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标题:请问长片段反转录PCR可行吗？

babybabe[使用道具]
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发表于 2011-9-15 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问长片段反转录PCR可行吗？

请问长片段反转录PCR可行吗？ [转载]


我要从总RNA中反转录出大小约6kb的片段，不知道是否可行？
还有如果可行，要注意哪些事项？
请各位大侠指教！！！！
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米米[使用道具]
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发表于 2011-9-15 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
绝对是可行的，不过rna的完整性还有RT酶的活性要求高
偶下个星期就要做一个5k的片断
但是如果要做后续步骤比如表达
就要考虑PCR反应的保真能力了；
BTW：最好用gsp引物而不是用oligo－dT反转
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蝴蝶结子[使用道具]
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发表于 2011-9-15 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也正在做长片断的PCR，作了几次都没成功。

郁闷呀！那位大虾可以指点指点。
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发表于 2011-9-15 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果没有把握，可以寻找目的片段内的天然酶切位点。
分段扩增，然后酶切连接也是一种办法，用这种办法理论上可以解决无限长的目的片段。
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babybabe[使用道具]
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发表于 2011-9-15 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我要连一个30KB的全长,小片段地连太恐怖了。
我想分成几个3.5KB 的片段来连。但是用常规PCR
做得并不理想。
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不懂[使用道具]
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发表于 2011-9-15 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
30kb如果源于RNA的话不用拼接法根本无法做出来。

建议用随机引物作RT,然后利用片段内的酶切位点用酶切法拼接。
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发表于 2011-9-15 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
强烈同意eeflying所言，正如鄙人在《之我见》一文中所说，长距离PCR尤其是反转录PCR的成功很小，虽然有些公司有长程taq，但是笨想一下，如果追求保真度，就要牺牲效率，反之亦然。
所以正像eeflying所说，而且耦认为不是建议，而是应该用拼接法。
虽然有报道可以达到数十KB，但是2个kb以上就是很难了，在保证正确的情况下。  
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发表于 2011-9-15 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那位大虾指教一下如何可以一次PCR 出3。9 K 的 片断。
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babybabe[使用道具]
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发表于 2011-9-15 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那位大虾指教一下如何可以一次PCR 出3。9 K 的 片断。
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发表于 2011-9-15 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于RNA来讲，你想扩出长片断，就要求你的RNA质量非常好了，而出不来结果你就得考虑是PCR的问题还是RNA的问题，反正很不容易。  
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