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标题:PCR求助

王六六[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR求助

PCR求助 [转载]


我是PCR新手，前些日子做出结果了，可最近几天就不出了，请问高手为啥？

PCR反应体系20ul ：dNTP 1.6ul，Taq酶0.2ul(5u/ul), DNA模板为2ul，10xBuffer 为2ul，上下游引物各1ul，25mM 的MgCL1.5ul。

反应程序：94度预变性10min，（94度30sec、55度45sec、72度90sec）共35个循环，72度延伸10min。  
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你引物种浓度是多少
好像有点多了啊
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不懂[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物不多——5u/ul
（1千单位的引物先稀释500倍，再取出10ul稀释10倍，分装备用）。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
预变性的时间一般3到5分钟的。
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王六六[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可我曾经作出过，同样的程序别人也可以用的。
还有出现过多条条带的情况，那这是为什么？
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发表于 2011-9-16 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物降解了
重配些试试

再就是酶活性，你换新的了？
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发表于 2011-9-16 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物、酶都是新的，是不是酶量大了？
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酶都是新的？
哪可能是这个批次的新酶不好
你的酶是哪里的？

另外，94度预变性10min完全完全没必要，太长乐，酶都失活了
预变性1分足够
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1 检查一下各种药品是否变质，可从新换药从做PCR
2如果你以前的PCR产物还有剩余，可以取之为模板，从新扩增
3仔细检查一下PCR仪的程序是否有出入
4增大模板量从新扩增
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王六六[使用道具]
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发表于 2011-9-16 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位啊，这两天出的结果是：有非特异性扩增条带，要不就是出现二聚体，那我该怎么办？  
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