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标题:关于realtime PCR的数据统计问题请教！

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发表于 2011-9-16 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于realtime PCR的数据统计问题请教！

关于realtime PCR的数据统计问题请教！[转载]


如果标本是做三次重复实验，应该怎样统计实验结果，请高手指点！
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-16 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果标本是做三次重复实验，应该怎样统计实验结果，请高手指点！

===================================

what is the meaning of 三次重复实验?
if in group, that is,3 repeat wells, using middle.
if between groups,using average.
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 小中大
是3 group，但是每个group之间的数据相差很大，有的相差10的几次方数量级，
我不知该怎样统计
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发表于 2011-9-16 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是3 group，但是每个group之间的数据相差很大，有的相差10的几次方数量级，
我不知该怎样统计
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发表于 2011-9-16 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
it must the problem of experiment itself .
but i do not know the exoriment of yours. if 4 gene exprssion, the certain gene itself can fluctate because of the template. but the ratio to the housekeeping gene should not change a lot. and our results are almost the same.
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发表于 2011-9-16 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用PE的TaqMan技术，7700机器，用普通的探针Fam标头Tamra标尾，探针25bp，用一份标本，更准确的说是一份Mix，1.2ml分装24管，作出的结果从10^5~10^7都有。所以这个方法很难避免完全的误差，所以我的建议是：
体系50或100ul好
反应中加入ROX参考荧光（PE的KIT中有加）
调整浓度在10^5-10^6copy/ml
每次试验调整机器一些细节参数，尤其是Cut线等
按PE说明书和部分文献，做四次，取其中的最接近3次做平均
统计时按浓度对数的平均进行计算，CV也按对数计算
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发表于 2011-9-16 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用PE的TaqMan技术，7700机器，用普通的探针Fam标头Tamra标尾，探针25bp，用一份标本，更准确的说是一份Mix，1.2ml分装24管，作出的结果从10^5~10^7都有。所以这个方法很难避免完全的误差，所以我的建议是：
体系50或100ul好
反应中加入ROX参考荧光（PE的KIT中有加）
调整浓度在10^5-10^6copy/ml
每次试验调整机器一些细节参数，尤其是Cut线等
按PE说明书和部分文献，做四次，取其中的最接近3次做平均
统计时按浓度对数的平均进行计算，CV也按对数计算

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请问ROX参考荧光的意义是什么？还有CUT线是否就是BASELINE，怎么调才算是最佳呢？除了调CUT外还要调整哪些参数。另外，我这个机器获得的拷贝数有些高或低的离奇，比如E+36，或E-34等，这不知道是怎么会事？请教了
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发表于 2011-9-16 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ROX是荧光的一种，PE 7700用的荧光是FAM，ROX，TEMRA，HEX等，ROX不是用来标记的，是加在PCR反应中，Report荧光的值是用Report荧光的值同ROX荧光的比值决定的，目的是消除荧光随温度变化而造成的变化。
你的结果如果是E＋36，一般是你的标准曲线设置有问题，或者你标本的CT小于15。
具体的设置还要根据你的机器型号决定，你要仔细研究一下说明。
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发表于 2011-9-16 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问一句，内参和阴性对照怎么样？
个人观点，realtime-PCR结果差异过大，可能是污染造成，这样实验数据其实完全没有多大意义了。
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seven7[使用道具]
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 小中大
内参差异不大，阴性对照应该也没有问题。我现在看老外的文章，发现realtime差1-2个10的数量级都是允许的，因为太灵敏了，不过我还是要找找实验中是否存在一些问题。谢谢大家！
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