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标题:哪里的taq酶保真度高，还可以直接TA克隆

mamamiya[使用道具]
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发表于 2011-9-16 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哪里的taq酶保真度高，还可以直接TA克隆

哪里的taq酶保真度高，还可以直接TA克隆 [转载]


上次用Takara大连分公司的Extaq premix扩增750bp片度，然后TA克隆测序（上海博采）结果居然有30个碱基突变，只好重做，请教哪种Taq酶保真度高？应该用哪种？一般的高保真的Taq酶不能直接做TA克隆吧，呜呜，该用哪种呢？？？？？急急急急
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-16 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议使用Qiagen公司的Proofstart Taq酶（基因公司代理），该酶是热启动＋高保真。可以扩增出很难扩出的片断。扩增出的PCR产物用PCR gel extraction kit（qiagen公司）胶上回收后，产物加入ATP 2ul，bufter及water，72度15min，POLY A 就加入PCR产物，那么就可以联入TA克隆。我做过这样的实验多次了，效果很好。还有，多次突变，你要好好寻找突变的规律，是不是同一个位点突变，那可能与酶保不保真关系不大（我遇到过这样的事情）。


[ 本帖最后由 #甜# 于 2011-9-16 17:31 编辑 ]
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发表于 2011-9-16 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
产物加A时要加taq酶吧
要不怎么加的上啊
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-16 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回复楼上的兄弟，加入POLY A需要TAQ 酶，但不影响保真度 ！
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发表于 2011-9-16 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的，具体用多少PCR产物回收，加入多少水，Buffer，ATP，Taq每呢？具体方案步骤，谢谢指点哟！！！！
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发表于 2011-9-16 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你如果怕麻烦
上海生工有试剂盒买
"平端DNA片段添A试剂盒"
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发表于 2011-9-16 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也正做TA克隆  
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blueeye[使用道具]
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发表于 2011-9-16 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么不考虑一下测序的准确性？？？有可能在测序时有错。 INVITROＧＥＮ的酶不错。
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发表于 2011-9-16 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Qiagen的hotstar很好用.Taq自动在产物末端加A，用introgen的TA cloning kits，很方便，而且copy 数很高
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夕阳[使用道具]
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发表于 2011-9-16 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
利用Tag加A尾步骤：
1－7ul纯化后的PCR产物（由高保真酶扩增得到）
｜
1ul 10 X buffer (with MgCl2)
|
add d ATP (final concentrition 0.2mM)
|
add 5 Unit Tag
|
add water to 10 ul
|
70 度 15-30分钟
｜
1-2 ul for T-vector lignation
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