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标题:[求助]关于realtimePCR条件如何摸索的问题

豆荚[使用道具]
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发表于 2011-9-18 08:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于realtimePCR条件如何摸索的问题

[求助]关于realtimePCR条件如何摸索的问题[转载]


各位大虾！
最近一直在做realtime PCR, 由于是叫公司做，先期摸条件都是他们在弄，自己很少能参与进去，但等到分析结果时发现了很多问题，却又不知道该如何解决
问题一：
我需要跑好几个基因，但公司跑的时候都用一个条件，说是增加基因之间的可比性，而且都用两步法，即94℃2分钟预变性，然后93℃10秒, 60℃40秒共40个循环，，但这样跑出来的结果是有几个基因如GAPDH是好的，但有几个就不行，出峰都很迟，且阳性对照都做不出来，明显是不对的。和公司的技术人员联系，他们说这样做是有道理的，因为两步法可以保证TAQ酶的活性，使结果更灵敏，且他们认为只要标准品跑得好就说明条件是好的。
但我也问过其他人，有说是标本应该另行摸条件的，而且应该跟普通PCR一样用跑胶的方法摸好了再去跑。
现在我的问题是到底应该怎样来摸索realtime PCR的条件？

问题二：
除了PCR程序外，还有PCR体系问题，现在我的体系是40ul，其中dNTP 200pmol/ul，引物各0.600 pmol/ul，荧光探针0.25pmol/ul, Taq酶2 u, cDNA 模板4 ul，也就是探针每个反应用10pmol，引物用24pmol.其实这样做是很浪费引物和探针的，不知能否再优化一些？

问题三：
还有，我发现做realtimePCR反应不同锅之间的差距很大，是否应该让所有的TEST都在一个锅里做才行，在做目的基因的同时是否每锅都得同时跑GAPDH？？

难过ing!!

各位高手千万给个解答啊 ~~~·
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豆荚[使用道具]
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发表于 2011-9-18 08:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我还有个问题，在设计探针荧光基团的时候是否都可以设计成为5‘端FAM，3’端BHQ1？
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清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-9-18 08:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ask the company that synthsiye the primer for u.
and the first queation, i think u have receive my mail?
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-18 08:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室GAPDH的Program：95度300s，95度20s，60度20s。
体系30ul，用的是Z－TAQ，Z-TAQ buffer(30nM Mgcl2)3ul, z-dNTP2.4ul,10pmoll/l的两种引物个2.5ul,primer2ul,z-taq 0,3ul, 水12.3ul,DNA or cDNA5ul.因为这是我们这里白血病的常规检查GAPDH，所以这个条件应该是很优化的。你可以试一下。
用Taqman系统通常都用2步法，这点不用置疑。另外，如果能把GAPDH的程序调的跟目的基因的程序一样当然好，样本不多时，一锅就可以出来，但是很多时候这样是行不通的。
如果你想重新作优化，重新定程序，能在real tiime上跑最好，但是很费试剂。最好是调整程序用普通PCR，优化体系用real time. 将样本稀释成不同指数级，一般是从10的0次方到10的4次方，选取反应效率在1左右的条件。
如果程序和体系的反应效率很好，应该是很稳定的，不同锅之间的差别不应该很大，同一样本的CT值相差最多1左右。
我可以把我手头的一些protocol发给你。另外设计探针，订货是我只写探针序列和5‘端FAM，剩下的告诉公司怎么好怎么做。
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发表于 2011-9-18 08:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的大侠，可以将protocol发给我吗？我们正准备做定量pcr！
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coolcool[使用道具]
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 小中大
楼上的大侠，可以将protocol发给我吗？我们正准备做定量pcr！
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-18 08:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不同意主任的看法; 意见如下。

1。 mg2+， realtime PCR 不应该小于5 mM (一下都是反应终浓度）
2。 dNTP 不小于400nM
3. primer 不小于400nM
4. probe 建议200nM

你的GAPDH每次都好， 是因为公司已经将她优化到极点
你的基因反应不好， 是因为1。 primer 没有设计好。2。 taqman探针没有设计好。

以上两个设计， 在Taqman-realtime PCR反应里息息相关， 不是1000-2000人民币能解决的

一个好的探针就要300US$, 你自己考虑一下， 那个公司收你多少， 他们能做多少
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发表于 2011-9-18 08:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
韩梅梅：
请教一下，怎样来判断一个反应体系是否合理呢？是否一定要做到大量标本检测以后才能肯定体系的稳定性？我们的体系优化后，Mg2+的浓度是2.5mM,并不是大于4mM。
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微笑的海豚[使用道具]
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 小中大
pinx,很长时间没有来了，protocol刚刚发给你了，希望不晚。
chiyue008：讨论:
我做了大量的PCR优化工作，主要是关于镁离子的，浓度从2到5.5mM，我的两种基因一种4.0下最优，一种4.4下最优。用的是质粒DNA从10的0次方到10的4次方，两个平行管，做9次，优化标准：扩增效率在0.98以上，R2在0.99以上。用taqman一般都需要做优化PCR这一步。
关于其他成分的浓度，刚开始我也是按照公司或其他资料建议的浓度，但是结果不稳定，后来同事建议我用一个现成的protocol,先优化Mg，如果有问题再调整。
我现在的两种基因都不符合你说的，但是反应很好，质粒DNA的标准曲线扩增效率为0。98和0。99，R2在0。995以上。
zynhy：建议先用质粒DNA做，系统稳定后再作标本，不然会很浪费的。
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 小中大
将我的protocol写上：

1. length:64bp
PCR BUFFER 10* （5mM Mgcl2） 3ul
Mgcl2 25mM 3,5ul
dNTP 25mM 0,35ul
sense primer 10pmol/ul 2,5ul
antisense primer 10pmol/ul 2,5ul
probe 10pmol/ul 2ul
hotstar 0,25ul
water up to 20ul
cDNA or DNA 10ul
2. length:94bp
PCR BUFFER *10 15mM Mgcl2 3ul
Mgcl2 25mM 3ul
dNTP 25mM 0,35ul
sense primer 10pmol/ul 2,5ul
antisense primer 10pmol/ul 2,5ul
probe 10pmol/ul 2ul
普通Taq(Roche ) 0,25ul
water up to 20ul
cDNA or DNA 10ul
Program: 95oc 600s
94oc 15s
62oc 60s
40cycles
我的内参用的是ABL，protocol与1。一样，program也一样。
事实上，除了镁离子之外，到现在我也没有算过其他成分的终浓度，但是体系很好很稳定，可能是我的幸运之处。
近两个多月，我一直在做RT-PCR系统优化，这个工作真是很痛苦，跑了都有上百遍realtime PCR了。而且当系统扩增不好时，有时自己也不知道是哪里出了问题。体会最深的：1.镁离子的优化，当从2mM做到5.5mM时，可以很明显看到扩增效率从低到高再到低的过程。但是工作量很大。
2. Taq 酶，没有任何一种taq适用于全部。我的l两个体系刚开始都用hotstar，结果一个体系怎么优化扩增效率只有0.7左右，换了taq后，扩增效率一下提高到0.95以上。
3. 退火温度： 两种基因taqman系统我从56做到64度，有点失之毫厘谬以千里的感觉，温度相差一两度，扩增效率可以有天壤之别。
4.对于引物和探针，两个引物只要能扩增出目的基因就算是符合基本要求了。事实上我的两个引物设计不是太好，Tm相差有点大，在Taqman系统没有太大麻烦，但是在SYBRGREEN系统中寻找退火温度时遇到不少困难，但是只要有耐心，是可以找到最优的体系的。
欢迎讨论！
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