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坐个沙发试试！！
在PCR专业版谈经验有点班门弄斧的味道，毕竟是新手上路。
暂且说一说自己将近一个月的PCR生活，希望和刚开始着手PCR的战友一起讨论一下
2008.4.1 自己经过几天的准备后终于开始了自己的pcr之旅，当时听师兄说过普通pcr其实难点就是提rna 和 引物退火温度摸索。漫漫pcr摸索苦旅即将开始，而且我需要测三个指标，着手前是相当的头疼啊。
不过很幸运的是经过三周多的试验，自己三个指标还算顺利的完成。如果非得说一下经验的话，或许自己最得意的还是rna的提取，前一段时间已经在本版发过应助贴，如下
1. 加trizol前PBS是否洗涤，去除死细胞
2. 震荡时避免应用斡旋振荡器，以防破坏RNA全长
3. 4度离心15分钟，12000g/分
4. 取上清（一定要小心，避免枪头碰到下面白色层）
5. 4度离心10分钟120000g/分
6. 上下颠倒使rna块悬浮，洗涤rna块
7.离心5min，12000g/分离心
8.倒掉EP管中液体，一般情况下，放置一会，肯定会有较多剩余乙醇，小心用枪头吸出，用不着非得等到干燥（个人意见）。
9加30ul DEPC水稀释
总RNA的提取
在一个就是引物的设计和退火温度的选择。引物设计方面奉劝一些和我一样的新手，千万不要轻信文献上的引物序列，包括国外的文献；当然对他们的不信任是一个方面，另外还要考虑，试验条件的不同所引起的误差。自己可以在引物设计软件上如oligo 和 priemer 下些功夫自己设计，再者可以找公司设计，但也需要自己对设计原理及一些原则熟悉，便于分析。 千万别忘了blast一下引物 ，看和你的基因序列匹配程度，及和其他基因非特异结合的情况。这些方法在园子里都可以搜索到
退火温度选择上，我是让takara合成的，由于我们实验室的pcr仪不能设梯度温度，一次只能取一个温度摸索，我就是取得合成报告单上两条引物退火温度的大约平均值的位置。结果全部出了结果，建议大家用takara合成的引物试一下。（师兄及其他高手说摸条件时一般情况是要比合成时报告的引物退火温度低4~5度，虽然有一定道理，不过我觉得并非定论）
一个和我一起跑的做了三次做出来，经验还是老一套，不过往往是在自己亲身经历后才能更理解：就是温度越低菲特异性就越高，特异性越低，但容易出目的条带；温度越高则相反。一旦没有目的条带，就得考虑降低温度（一般以2度左右为阶差），但非特异性条带出现的几率就更大了。
其他的除了操作方面规范，不要少加或多加了试剂（实验室里经常犯的毛病，毕竟pcr试剂盒的试剂种类还是有点炫目，呵呵），是不会出什么问题的。
