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标题:不用探针，用荧光定量RT-PCR测mRNA量可行吗？

米米[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不用探针，用荧光定量RT-PCR测mRNA量可行吗？

不用探针，用荧光定量RT-PCR测mRNA量可行吗？ [转载]


本人拟测ET-1mRNA在干预后的表达变化，
但因经费，不能做荧光探针的定量PCR，考虑做
荧光染料的方法，先用mRNA，逆转录生成cDNA，
再进行荧光定量PCR，这样可行吗？
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米米[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是也可以做呀？
因为RNA经逆转录生成cDNA,
扩增后的产物是DNA，同样可以用SYBR GReen染料
是不是呀？
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米米[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
荧光定量PCR一种是用荧光探针，一种是用荧光染料。
我目前看到的是用与双链DNA特异结合的荧光染料SYBR GReen
加入PCR体系中，将一般的PCR，变为定量PCR（其中必需用到
荧光定量PCR仪），因染料便宜，120元的染料可作200次，故我
拟用其测mRNA定量表达情况，当然先用RT-PCR，生成cDNA,再进行
荧光定量（用到相关软件进行分析）。我的设想是这样的，但不知行不行得通。
以下是荧光染料的情况：
cuturl('http://www.ope-tech.com/products/SYBR_Green2.htm')
cuturl('http://www.ope-tech.com/products/SYBR_Green.htm')

请高手说什么也要看一看呀，说说其有没有可行性，用以上方法测出的可作为
mRNA的定量表达吗？
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该是可以的，当然特异性较探针法差一点，我也没做过，正打算用这种方法摸一摸条件，如果是时间和经费充足的话，再用探针法作，此外也可以用一步法的RT-PCR盒作，ABI和ROCHE都有相关的试剂盒（好像都不便宜，ABI的要近7000，ROCHE的也得4500）。我现在也搞不太懂一步法和两步法荧光定量RT-PCR哪个更好些，我的看法是两步法可能好些，因为可以较好控制模板（cDNA）的量，可减少些误差。
还有，丁香园里有很多荧光定量PCR的高手，你可应用搜索功能搜一下，会有不少的收获，本来想给你粘上篇从园里查的文章，但还不会用这个功能，题目是 《实时定量PCR应用中的问题及优化方案〉（忘了作者是谁了，在这表示感谢）你可以自己查， 怕麻烦的话我可以法给你。不过有时间还是自己在园里多看看。
我也不是什么高手，不过三个臭皮匠还定格诸葛亮呢，我也马上要开始做了，以后多多交流经验，少走些弯路。
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没问题， 先决条件是 你的PCR效率要非常的高， 一定要一条产物， 而且没有primer dimer.

解决的办法很简单， 讲你的PCR产物控制在100bp以下  
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米米[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
怎么样将我的PCR产物控制在100bp以下呢？
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我都是在国外的文献上查的，均是用于定量pcr的（不过是探针法的）设计的产物都在100bp左右，但也不能保证均好用，我现在在用普通pcr验证，此外在ABI70000的仪器上附有引物设计软件，可以自己设计。
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发表于 2011-9-19 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用syber green I可以，有关特异性不好的问题，你可以参考香港有关SARS诊断的一篇文章，好像是在Anal Chem.上，相信很有用。
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喵咪[使用道具]
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 小中大
不好意思，文章是Poon LLM, Wong OK, Luk W, Yuen KY, Peiris JSM, Guan Y. Rapid diagnosis of a coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS).
Clin Chem 2003;49. Published online April 18, 2003 (cuturl('www.clinchem.org')).
如果要的话，留个地址吧。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-19 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以， 不过SYBR的非特意性较强，所以我认为最好用一步法，因这样可以避免SYBR的非特意性结合，PCR完成后，你可以考虑再跑一次电泳，验证一下实验结果，不过会造成PCR产物的污染！
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