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标题:【分享帖】实验进度--从一个菜鸟开始

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发表于 2015-10-10 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享帖】实验进度--从一个菜鸟开始

从今天起，开始记录自己的实验点滴和文章情况。
很多外周血标本冻在-80度冰箱了，今天准备取出来，用AXYGEN的血DNA抽提试剂盒来抽提基因组DNA。不知道效果会如何。接下来继续PCR。引物借用文献中的，文献没附带的引物，直接往通讯作者的邮箱发邮件要的，第二天就回了，真的很感谢。引物送生工合成,HAP纯化法比较便宜，挺好用的，没发现有问题。
今天第一次跑SDS-PAGE。从生工买的蛋白Marker不好用，15ul的量，看不到清晰的条带。还是借用了师兄以前好用的Marker用的。上样的蛋白是目的基因PRF1转染CHO细胞之后的细胞裂解液，流式细胞仪检测到有目的蛋白表达，今天用SDS-PAGE验证一下有没有目的条带。
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发表于 2015-10-10 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不算菜鸟吧楼主，看样子混实验室时间不短啊
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发表于 2015-10-10 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PE-Cy5（替代PerCP）与APC不可以同时用在四色流式中，补偿无法调节。我自己的流式结果和我们实验室别人的流式结果强烈验证了这一结果。重新选抗体颜色的组合。
BD(Beckton Dickinson)公司的流式细胞仪则不同,其在早期即配置了四个检测通道,但不是由单个激光激发,而是由两个激光器激发,一个为488nm氩离子激光器,可激发FITC, PE和PerCP(BD的注册商标)[PerCP可被TC或PE-Cy5所替代].另一个为633nm的氦氖激光器,可激发APC.BD FACSCalibur机器即为此种配置,且具有软件调节补偿的作用, 可很好地调节FITC, PE, PerCP及APC间的补偿.但由于PerCP标记的荧光抗体种类比较少,所以在实践过程中多用TC(PE-Cy5)标记的抗体来替代。然而在使用PE-Cy5时，会经常发现补偿十分难调，PE-Cy5与APC间的补偿甚至超过90%, 有时根本无法调好。这是因为PE-Cy5为 "tandem"(阵列)型荧光染料，PE与Cy5依靠能量转移(Energy Tansfer)来实现荧光的激发与发射。而我们知道能量转移的效率有赖于两种分子间的距离，如距离稍有增加，则能量转移效率则会大幅下降，也就是说，PE-Cy5将分裂成两种染料，PE和Cy5。Cy5与APC具有相似的激发波长，在BD FACSCalibur机器中均可被第二个激光器所激发，因此造成补偿难调的情况。
那么如何解决上述问题呢？"诀窍"有几个：
滴定降低 PE-Cy5抗体的使用浓度,使得在不影响抗原检测的同时,得到较好的补偿调节PMT(光电倍增管)的电压(HV)，方法是:提高FL3通道的PMT电压，用以检测PE-Cy5。同时降低FL3通道的PMT电压，用以检测APC。目的是使在FL4通道中尽量减少对Cy5的检测量。
使用美国Caltag公司PE-Cy5.5标记的抗体来替代PE-Cy5标记的抗体，可以非常好的解决此问题。如其公司网站cuturl('www.caltag.com') 上的 PE-Cy5.5 Tandem Dye for Use in Multi-Color Flow Cytometry - flyer 所述,PE-Cy5.5与APC间的补偿仅为1.0%，非常的小。而且，PE-Cy5.5可与PE-Cy5,PE-TR,PE-Cy7等染料一起实现对细胞进行单激光6色的同时检测和分析。因此是最为推荐的解决方法。解决原理为PE-Cy5.5虽然也属"阵列"型染料，但Cy5.5比Cy5的激发波长要长得多，在700nm左右，因此可激发APC的第二激光器(633nm)无法激发Cy5.5,使得PE-Cy5.5与APC间的补偿非常小。
补偿是否容易调节还与PE-Cy5标记抗体的特异性和供应厂商有关。有研究表明，使用美国Caltag公司的CD5-TC时，TC与APC间的补偿比较难调，而用该公司TC标记的其它抗体，如CD19, MAC-1和HLA-DR等则比较容易调节补偿 .
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发表于 2015-10-10 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天用淋巴细胞分离液分离了两支外周血，一支肝素钠抗凝，一支EDTA.K2抗凝，与K562细胞共孵育。 后面一支血的活性明显下降。有点郁闷。 今天上园子里来搜了一下，果然EDTA抗凝的血，不适合细胞培养。
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发表于 2015-10-10 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
WB 用的蛋白ladder 买了Fermentas的， 一支250ul， 价格280元。 每次上样10ul,条带非常好。推荐下。
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发表于 2015-10-10 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

自己的中文的综述终于可以在线查阅了。虽然写出来的水平极其有限，杂志也极其普通，还是很开心。毕竟是自己真正意义上的第一篇文章。
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发表于 2015-10-10 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近在制作会议用的壁报。本来自己用PS全部做好了，但是文字太多，图片不够多，重新返工。壁报返工，远比文章和实验返工要轻松，因为壁报的内容只是一片文章的摘要的内容。 我们实验室有师兄热爱写SCI，每天不厌其烦地修改他的文章。结果就是他的文字很洗练，文章发的影响因子也比较高。 不厌其烦，是一个非常有魔力的词语，在做实验和写文章上。必须学习热爱这种重复性的生活。
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发表于 2015-10-10 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老板如果给你课题了，这还是比较乐观的。这种情况下，用Pubmed搜一下自己相关课题的最近3年的文章，看看自己这个课题国内外发文章的套路。
国外作者的文章需要哪些核心实验支撑，自己的实验室有没有这些实验条件。如果有，自己需要多久、需要通过什么途径掌握这些实验技术。国内作者已经做了哪些实验，自己要做的话，还有哪些创新点（比如，你收集的病例的地域性目前还没有人发文章，或者你收集的病例数比人家多，或者你做的实验在机制探索上可以比别人的更进一步，等等）。一个小的创新点，加上可靠的实验结果，就有可能出一篇不错的文章。
如果你的课题需要你自己确定，老板只是给你一个方向，那你一定要反复跟老板沟通，看他潜意识里比较希望你研究哪个课题；他自己比较擅长的方向是哪几个；你老板以前发的文章，都写的是什么（中国知网、维普、万方、Pubmed，把你导师名字输进去，自己查就可以）。确认好课题之后，就可以了做了。
或者也可以先熟悉实验技术，课题在练习技术的过程中慢慢确认。
我刚进实验室的时候，课题老板已经给了。我的问题主要是自己特别雄心壮志，老看cell/science/blood这些杂志，自己课题相关的小文章读得不够多；学实验技术时，贪多，什么都学，没有专心于自己课题相关的几项核心技术。这样下来，吃了很多苦头。现在终于进行深刻的自我反省和改正。
祝你早日找到自己的重心和方向。
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发表于 2015-10-10 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天和今天第一次跑全套的Western Blot.
用外周血1.5ML,淋巴细胞分离液分离，4度预冷的PBS洗两遍。细胞裂解液500UL+蛋白酶抑制剂（MG 5UL+PMSF 5UL）冰上裂解30min。取30UL裂解液，加6×SDS裂解液6.6UL, 1M DTT 4UL, 100度煮沸 5min。
胶提前做好了。电泳。每孔上样20UL, 100V 10min, 120V 60min。
转膜。按照阳极、海绵、滤纸、PVDF膜、胶、滤纸、海绵、阴极，放好。三明治一半泡在转膜液里。冰上转膜，120V 60min。膜转的挺好看的。
封闭液加好，将PVDF膜放在4度冰箱过夜。
今天。
在5ML封闭液中加2ug一抗，室温孵育2h。摇床速度调的低速。
1×TBST,漂洗三次，每次20min,每次换新液。
在5ML封闭液中加1ug二抗，室温孵育2h。摇床速度还是调的低速。
1×TBST,漂洗三次，每次20min,每次换新液。
显影。暗室，A液+B液各5uL 混匀，放置1min后滴到保鲜膜上的PVDF膜，结果：无荧光。
接下来的显影、定影和冲洗都忘了做，直接把胶片压好后拿到室外白光下了。结果就是：肯定没有条带。
问题出在哪一步。
1.细胞数不够多，即上样的蛋白含量不够；
2.孵育时封闭液过多，一抗和二抗孵育效果不好。
3.抗体有问题。
4.细胞裂解液中不存在目的蛋白。
暂时总结不出别的原因来。下次再做，先把第一和第一条的原因纠正了，看看会不会有目的条带出来。
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发表于 2015-10-10 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的兄弟，你的内参跑出来了没？
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