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标题:专攻PCR，有问题尽管问！

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

专攻PCR，有问题尽管问！

如题：专攻PCR，有问题尽管问！~尽我所能回答~[转载]
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=66188&sty=1&tpg=1&age=0&ppg=13
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发表于 2011-9-19 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
基因拼接：启动子（2.8kb）与目的基因（950bp）通过基因拼接法连接，中央重叠区为46bp，但是每次连接扩增总是有很强的目的基因片断条带，连接产物产率极低甚至没有，曾采用先将启动子与目的基因单独反应5个循环，后加入两头因为进行30次循环的方法。但效果依然不明显，并发现用宝生物LA酶扩增的效果极差，用宝生物高保真酶Pyrobest扩增效果相对较好，但目的片断产量很少，无法回收，请老兄不惜赐教！！
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发表于 2011-9-19 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
偶的问题

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发表于 2011-9-19 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
已经有目的片断产量很少时，可以用PCR产物作为模板，条件严格一些再进行一次扩增，估计能够得到足够的量。

引用文献的好。但是要自己验证。
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发表于 2011-9-19 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于引物
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=350428&sty=1&tpg=6&age=0')

===============================================================================================================

还想请问为了验证，我用promega 的反转录试剂盒合成cDNA第一链，用Takara的Ex Taq酶作pcr,反应条件设为94--5min 94度45s 55度30s 72度30s X30 cycle 72度5min, 合适吗？
另外热启动的酶（用抗体封闭）应该怎样用呢？是先94度5min后再加入酶进入循环，还是一开始就可以加入？我以前用普通的Taq酶都是先94度10min 后迅速置冰上再加入酶，放在pcr上直接开始循环，用热启动的酶是不是就不用这样了？
谢谢！
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发表于 2011-9-19 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.本人细胞数量有限，所以在用trizol提取细胞总RNA时，肉眼无法观察到RNA沉淀，请问是否还有必要继续测定RNA的含量。

2.PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。
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速冻虾米[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问TaqMan探针有没有保质期，最长能够保存多久（稀释后）？
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的引物可以使用。做荧光定量RT-PCR，用两步法就可以了，推荐的反应温度94--5min 94度15s 60度60s X35--40 cycle 。
用热启动的酶，一开始就可以加入，并与10XBUFFER，Mg++,引物、探针等混合，分装后加入模板，直接进行PCR循环。
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.本人细胞数量有限，所以在用trizol提取细胞总RNA时，肉眼无法观察到RNA沉淀，请问是否还有必要继续测定RNA的含量。

2.PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。

答：1。没有必要。
2。可以。并且经常这么用。
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