生物质谱

目前在做酶的分离纯化，报道的仅有4个相同功能的酶，但是比对后基本没有保守序列。。。
我做的菌也没有全基因组序列。。。
是不是只能一步一步纯化，直到SDS一条带？
实验时先过阴离子交换，后过分子筛，但是效果也不好。SDS的杂带较多，但是有一条带貌似是要找的。不知切胶做N端测序可不可以？引物如何设计呢？
还望请大牛们指点。谢谢了

你的是重组酶还是野生酶？

野生酶。目前只有5个报道，找到的4个基因根本没有同源性。。。。。。。

1、        你的菌既然没有全基因测序，那么就不能设计引物来直接克隆。
2、        如果报道的仅有4个相同功能的酶，但是比对后基本没有保守序列，那就是说你的酶纯化出来之后可能会容易发文章。
3、        蛋白质纯化是需要一步一步来的，野生酶只要一步就能纯化就很夸张。
4、        为什么要先用离子交换层析柱？无论什么方法来培养的微生物，得到的酶，都会有很多杂质，包括细胞碎片和培养基成分等等，还有一些盐，这样的酶液要用离子交换层析柱就必须先去盐，而且有一些杂质还不一定能用0.22微米的滤膜过滤去掉，所以我认为第一步可以先用某种方法来初步纯化，例如硫酸铵沉淀和小分子有机溶剂沉淀，这样能去掉很多杂质，包括一些蛋白质杂质。假如是硫酸铵沉淀，那就可以立即用疏水层析柱，假如是有机溶剂沉淀，那么下一步可以去掉小分子有机溶剂，反正也要脱盐的，盐和小分子有机溶剂都可以被除掉。这样一来就更好了。
5、        凝胶过滤的效率是比较差的，不到不得已就别用，而且要求上样的样品体积要小，在缩小体积这一步说不定会损失蛋白质，说不定你的酶也有损失。
6、        既然条带很多，那就说明你要的那条带说不定也不纯，打质谱都可能打不出来，测序也一样可能测不出来，还是先纯一点再考虑切胶保险。

谈下俺的建议。。我感觉首先应该先按照分子量先过一个分子筛。。粗分下符合分子量范围的蛋白。。然后再过阴离子（当然是根据您蛋白的性质）进行细分。。如果离子交换分的还不干净的话。。来个强阴离子交换。。先阴离子的话我感觉。。毕竟载量有限。。杂蛋白很多。。可能你的目的蛋白结合效果不会太好。。会有较多浪费。。不如先分子筛再离子交换。。至于测序的问题。。N端的蛋白测序好像不用设计引物捏。。质谱好像就行。。当然N端的10个之内好像挺准（价钱好像也不贵捏）。。太多恐怕就信号不太强了。。。不知道你这个左右的氨基酸能否作为鉴别标准。。

我不建议第一步就是分子筛，理由是
1、分子量还不知道是多少，因为已经报道的基因没有同源性，不能依靠这个来估计自己的酶的同源性。当然如果能测定酶活力的话也不存在这个问题。
2、粗酶液里杂质较多，如果一下子把体积浓缩到很小，那么杂质会沉淀，会带动一部分酶也共沉淀，造成损失。
3、如果用离子交换层析，即使蛋白质太多，超出载量，那也是在穿透液中，可以再次过柱，蛋白质不会有任何损失。
4、N端的蛋白测序确实不用设计引物。
5、质谱和测序的问题，我是不建议立即做的，理由就是单条带也可能不纯，因为蛋白质太多，所以存在两个蛋白质跑到一起的隐患。
6、离子交换层析不只是阴离子交换，还有阳离子交换层析的，这就看蛋白质的等电点了。
楼上的猴子路飞怎么把草帽换了，那是梦想，不能换。

谢谢您的建议，我下一步试试疏水层析。因为在用阴离子交换的时候，改变了PH，洗脱梯度，发现出峰的范围基本在5-20毫升之间（洗脱体积），不怎么变化。是不是硫氨沉淀后的盐浓度过高导致的？如果是的话，疏水层析就必须做了，呵呵。请您指点，谢谢。

请问疏水层析柱什么牌子的比较好呢？

做n端测序不用纯化，公司跑个非变性胶，问你切哪条带，你告诉他们你要测的条带，然后后面的事情就是他们做了，切胶这一步要400元。

疏水层析柱我们的是GE预装柱，用AKTA纯化仪，如果没有纯化仪，层析柜也可以，填料也可以买来自己装柱，不过效果肯定就没有用预装柱用纯化仪的好了。先做着吧。牌子问题也不用太注意，你问这个问题我是不是可以猜测你们实验室没有疏水层析柱，甚至连填料都还没有？没有贬低的意思，我们也是这两年才有的。
至于楼上说的切胶，我是一向不建议的，原因已经说过2次了。