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多谢楼上的兄弟回帖，看了你的建议，我又重新回顾了一下最近的实验，想再总结一下。
昨天情绪极其低落，以至于都发的帖都难看啊。
这学期以来，一共复苏了6瓶细胞！！！有8代的，10代的，不超过12代，我的方法是直接加10ml完全培养基（DMEM+10%CS），放培养箱4小时，观察细胞贴壁后弃去以上培养基，更换新的培养基过夜培养。2天以后再换培养基，如果长到70%就及时传代。每批细胞复苏的贴壁率不等，都还可以，最多不超过8小时，都可部分贴壁，含DMSO的培养基没有过夜培养的，复苏后再次传代时间也不超过4天，3T3L1细胞长的很快，又不能长太满，所以4天以内都可以传代了。
这学期的培养基刚开始是自配的，血清都是HYCLONE的，包括CS和FBS，一直是同一个供货商，其他同学都用，都没有异常。
胰酶这学期配的，但是以前我们加EDTA，这次那个配的同学不知道为什么，就没有加，所以消化时间的确有延长，以前一般消化1分钟，基本大半都下来了，现在消化时间延长到5-8分钟，但绝对没有超过10分钟，回种后细胞生长正常，过夜贴壁很好，然后如果1比5传代的话，3天以内就可以再传了，个人觉得生长速度没有改变。
一般传2代之后种皿，一般一瓶75cm的细胞我可以种4个6孔板，细胞很够，回传比例是1比10,4天左右就可以再次种了。
皿继续DMEM+10%CS培养到长满后2天，一般需要5-6天时间，换DMEM+10%FBS和分化试剂，第一天状态很好，细胞变圆，变大，飘的细胞很少，第2天换胰岛素的时候感觉还好，飘的少，可是到3天，飘的细胞就多了，接下来基本每况愈下，那个飘啊，就不提了，那个心情啊，一天比一天差啊……
发现问题后，我立刻重新配胰岛素，地塞米松因为订不到新货，只能把以前用乙醇配的（第一次配置的储备液，用PBS稀释后分装，分化成功过），放在-80°，拿出来用PBS稀释后分装，IBMX夜重新配了，都是按照最开始的方案，都是最开始用的货物批号。
同时更换了培养基，订购了迈晨公司配置的液体DMEM，设计了一大套对比实验组，基本就是4种变量：培养基，胰岛素，地塞米松，IBMX，分别有两批，旧的和新的，用排列组合的方式，一一对照，当时做的，那个疯啊。
分化后第一天，各组没有明显不同，到第二天，发现凡是旧的培养基，细胞飘的多，当时心中狂喜，是不是培养基出了问题，结果，到了第3天，新的培养基也飘了， 4天，分化细胞少见，到了第6天， 各组差异全部消失，飘的飘，贴壁细胞也是层次不清，一塌糊涂！！这个实验只能证明我的试剂，新旧没有差异！！但是，都没有用！！哎呀，我写到这，真的想骂人啦。
昨天订购了新的细胞，大约1周以后可以去拿（协和细胞中心），然后，找公司订了GIBCO的血清，以前GIBCO和HYCLONE的血清我都作过，差异并不大，都能分出来。现在，基本没有什么是不可以怀疑的了，只能试试看。今天有申请了HYCLONE的澳洲血清试用，这个比我现在南美血清要贵一些，看是不是可以改善啊。
楼上说的问题，“但你的细胞又是同一批保种的，之前取出来都正常。所以除非细胞后续的保存出了问题，或者血清污染了支原体，你确定更换的血清也是好的？培养基是自己配制的还是买的液体？自己配制的培养基，水源有没有检测过pH正常，电阻值正常？还有一个办法是全部使用其它实验室的培养体系（当然确保他们用的东西，都是高质量的进口试剂和溶液），看看有没有问题。”都非常关键，在此小妹谢过啦。
照着分析一下， 实验室细胞保存在液氮中，液氮罐不是每周补充，但没有空过，就是补充的不定期，有时候很多，有时候很少，会不会这个也影响细胞啊……疯了！！
血清支原体污染不确定，但实验室的卫生条件一般，确实有问题，我打算购买支原体抗生素，以后这个常规加吧。
水是中科院一个公司的， 用了快1年，全实验室都用啊，就是我出问题……再一次疯了！！！
这几天又去公卫楼买了去离子水，北医的公卫楼的水据说是不错，2块钱一升啊，价格也不错！以后配东西用这个！
我们的培养箱，是松下的，大家用的都没问题，就是我的细胞不成，我也不知道该不该考虑是它的问题！疯了！！！
其他实验室的体系用起来，操作实现起来比较麻烦，到最后不行再努力吧。
准备订购液体胰酶，自己都不敢配东西了。
现在进展如此，疯了！疯了！！！同学都拿我当反面教材，考虑是不是要同时作2个独立的课题，这样不至于向我一样，毕业前挂掉！！！老板都不批评了，同意我随意订购昂贵的试剂！！
有新进展，我会再说出来，现在，基本用无谓的体力劳动充实自己死掉的心。这一周，把自己所有的塑料，玻璃容器都重新超声，泡酸，清洗了一遍。
WHAT ELSE CAN I DO?
