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标题:求助:外周血淋巴细胞的RNA提取

丁香@@[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助:外周血淋巴细胞的RNA提取

求助:外周血淋巴细胞的RNA提取[转载]


我要做外周血淋巴细胞的RNA提取,请问我是采完血后一个一提呢,还是先冻存在液氮中,一起做?
冻存后会不会影响RNA的量?
请赐教.
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 小中大
这需要看你自己的情况,如果标本每次只有少数几个,而后续工作,如RT,或者其他,均已准备好,你抽一个做一个也无妨,但是从你的情况推测,你目前只是在收集标本,所以建议:采血后立即用液氮冷冻,然后可以在-70度冻存,直到你开始抽提RNA,这样不会影响RNA质量,当然,如果你采的血量多,可能多次抽提,那你最好在液氮冷冻前先分管装好,这样可以避免溶解血标本的需要.
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 小中大
这需要看你自己的情况,如果标本每次只有少数几个,而后续工作,如RT,或者其他,均已准备好,你抽一个做一个也无妨,但是从你的情况推测,你目前只是在收集标本,所以建议:采血后立即用液氮冷冻,然后可以在-70度冻存,直到你开始抽提RNA,这样不会影响RNA质量,当然,如果你采的血量多,可能多次抽提,那你最好在液氮冷冻前先分管装好,这样可以避免溶解血标本的需要.
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 小中大
谢谢您.还想问一下,用液氮冷冻时,是否加冷冻液?

是一直在液氮内放着好,还是然后放-70度冰箱里好?
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 小中大
不用放冷冻液，直接放液氮里。冻好后再放-70即可。只要操作迅速（速冻细胞），RNA的质量就不会受影响。
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发表于 2011-9-20 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的意见是可以先提出细胞（采血用EDTA或枸橼酸钾钠抗凝）来，再低温保存细胞，然后一起提RNA，再做其他如RT-PCR什么的
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 小中大
最好不要全血冻存，否则再溶解时容易导致溶血，影响淋巴细胞的分离。可以在分离出淋巴细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。若用TRIZOL试剂提取总RNA，可将TRIZOL加入淋巴细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。 这两种方法都不会影响RNA的质量，而且同一个一个提取标本相比，攒一批标本同时提取，可减少因提取标本造成的误差，实验结果更为准确。
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 小中大
最好不要全血冻存，否则再溶解时容易导致溶血，影响淋巴细胞的分离。可以在分离出淋巴细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。若用TRIZOL试剂提取总RNA，可将TRIZOL加入淋巴细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。 这两种方法都不会影响RNA的质量，而且同一个一个提取标本相比，攒一批标本同时提取，可减少因提取标本造成的误差，实验结果更为准确。
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 小中大
想问: 为什么要在淋巴细胞中加TRIzol后冻存呢?必须加吗?加多少?加完后再抽提RNA时怎么算TRIzol的量?,
另外,先冻在液氮,然后放在--70度冰箱.想问:一直放液氮里行吗?放在液氮多久算冻好了,然后放冰箱?
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 小中大
不作细胞培养时对细胞的冻存要求并不高，冻存前不加也行，但保存条件可能相应要高，因为要避免冻融过程对细胞的损伤影响RNA的质量。加TRIzol后，室温５分钟即可将细胞裂解，可能此时冻存缓冲能力高些吧，我不太清楚其原理，是我导师要求我这样做的，当时没考虑这么多。我当时放在－２０度冻存，如果时间相对较长，你可以考虑冻存在－８０度或－７０度，我个人认为如果不做细胞培养，仅提RNA的话，不必液氮冻存。加入的TRIzol的量可根据说明书计算一下，取决于你的细胞数的多少，一步加足，以后溶解后直接进行后续步骤即可。
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