小中大痛不欲生之RT-PCR2
痛不欲生之RT-PCR2 [转载]
请教各位前辈，我做RT-PCR做到悲痛欲绝，肠断无泪。请各位大侠帮我分析。我从培养细胞中提RNA，RNA电泳3条带清晰，比例均可。测RNA浓度，在0.5到3之间，用AMV及随机引物，37度1小时做RT， 以GAPDH（鼎国，400多BP）为内参做PCR，目的基因片段为584BP，反复做，目的基因及内参均未扩出，但可见引物二聚体，请问，那一步出问题？RT还是PCR？是否要换用MMLV（但MMLV扩长片段，我的基因是一短片段），随机引物与OLIGDT15或18所需RT温度是否不同？用随机引物需37度1小时，用OLIGDT15或18需42度1小时？
前辈们指点得极是。
分析原因可能如下并逐步排除：
1.提RNA中，RNA质量不好及降解，但经RNA电泳和紫外测浓度证实RNA提取过程无误。
2.RT： 为排除RT操作有误，请同室熟练操作的师姐用我的RNA样品再次行RT，但其RT产物也未见目的条带和内参。
3.PCR：引物序列和目的基因扩增条件是别人做出来的，就是说引物设计和PCR反应条件无误；
用肯定可以扩出目的基因及内参的RT产物（cDNA），作为positive control ，同时做PCR，但二者均未扩出；.......提示目的基因及内参可能有问题？
用肯定可以扩出内参的RT产物包括人，鼠样本各一，以验证是否内参存在问题，结果人cDNA可扩出内参GAPDH，鼠cDNA未见内参GAPDH；......提示内参只能扩人，而我的样本为鼠，所以出现目的基因及内参均未扩出的结果，故不能就此推论RT有误。
为进一步明确是否内参引物同时有问题，再次用GAPDH扩鼠肯定可以扩出内参的cDNA，仍无结果；.......证实GAPDH不能起到内参作用。
那么问题在哪呢？？？？？？？
RT过程RNA降解？（操作中已备加小心并由熟练的师姐重复过RT）
若引物设计无问题（已证实设计引物能扩出目的基因），那引物合成是否有问题？
是否可用PCR引物为RT的特异性引物做RT？
除上述因素，还有哪些是没考虑到的？
....................
