RT(逆转录）的问题

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标题:RT(逆转录）的问题

DDD[使用道具]
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发表于 2011-9-20 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

RT(逆转录）的问题[转载]

Promega公司的M-MLV酶做逆转录的时候，要先把RNA和引物70摄氏度5min，然后冰浴，再加别的成分。可是我看有很多文献上面并没有这一步。请问这样做的目的是什么？可以省略吗？

blueeye[使用道具]
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发表于 2011-9-20 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的也是Promega的M-MLV，什么目的不太清楚，可是我觉得最好不要省略吧，公司这么写肯定有原因罗。我用过Gibco分装的M-MLV，说明书不是很全，我一股脑全加在一块，PCR也能出来结果，可是没有Promega的条带亮。

不懂[使用道具]
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发表于 2011-9-20 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那原因我想是使卷曲的RNA链展开,便于引物结合上去,这样做是有道理的.

许愿精灵[使用道具]
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发表于 2011-9-20 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那原因我想是使卷曲的RNA链展开,便于引物结合上去,这样做是有道理的.

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可能就是这个原因!

缘yuan[使用道具]
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发表于 2011-9-20 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能就是这个原因

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就是这个原因，还有打开RNA的二级结构，可以防止RT过程中防止RTase在碰到RNA二级结构复杂的地方停止逆转录，得到更多全长cDNA。

缘yuan[使用道具]
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发表于 2011-9-20 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2011-9-20 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意你的意见，RNA单链结构的特殊性，使得它很容易形成二级的发夹结构，70度孵育的目的就是使二级结构打开，保证逆转录的顺利进行。而且在实验中还有一个问题要特别注意，就是70度孵育后，要将RNA和引物混合物立即放入冰里，使之迅速冷却，否则如果缓慢冷却的话，二级结构可能又会形成。当然有些情况下，可能你所要扩增的那部分序列对应的RNA不会形成二级结构，如果不作这一步可能没有问题，但是对于相当一部分扩增序列，这么做还是有必要的。

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发表于 2011-9-20 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢！
那么我还有一个问题：怎么知道我要扩增的序列会不会形成二级结构呢？我要逆转录的产物片段长度为200bp，这么短有没有什么影响？
我做个实验是不是可以验证一下，RNA量要少一点才有说服力吧？？

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发表于 2011-9-20 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上面他们说的是一个普遍的道理，我想对于你的特定的情况，你的想法也有一定的道理，不能排除你要扩增的片段直接加实验成份也能得到你要的靶片段。我想你可以做一个对照实验验证一下。就是你平行地做两个不做预处理的RT-PCR，同时做两个按说明书做预处理的RT-PCT，然后看结果，就完全知道这种预处理对你的片段的RT-PCR的影响了。每一个做两个是为了排除偶然因素的影响。

羊咩咩[使用道具]
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发表于 2011-9-20 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实，你的实验目的是RT-PCR扩增到你要的片段，而不是要知道你的片断对应的RNA部分会不会有二级结构。你照要求的70度抚育就可以了，这样对绝大多数的片断扩增应该都没有问题了。

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