小中大叶绿体色素简便提取方法
采用上述研磨方法提取叶绿体色素，既费工费时，又容易出现误差。为此，可采用乙醇–丙酮混合液浸泡法。其方法是，将待测叶片剪碎，装入具塞刻度试管中，加入乙醇–丙酮混合液（ 1︰l ， v /v ）10 mL ，使叶片完全浸入液体之中，加盖。放置于暗处，如能置于 30～40 ℃温箱中更好。当叶片完全变白时即可比色。此法简便易行，重现性好，尤其适用于大量样品的测定。最好是在浸泡过程中轻轻摇动几次。
这个方法是和比色一样的道理，你可以参照下面的方法计算，
叶绿体色素的定量测定
一、实验目的
1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。
2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。
二、原理
叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：
1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。
2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯–比尔定律，某有色溶液的消光度A与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即： A = kCL
式中： k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， k 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的消光度 A，并根据叶绿素 a、b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a、b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素 a、b 的 80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm 和 645nm ，又知在波长663nm下，叶绿素 a、b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04和9.27，在波长 645nm下分别为 16.75 和 45.60 ，可根据加和性原则列出以下关系式：
A663 = 82.04Ca +9.27Cb （1）
A 645 = 16.75Ca +45.60Cb （2）
式中： A 663、A 645 ——叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度；
Ca、Cb ——叶绿素a 和b的浓度， mg/L 。
解方程组（1）、（2）得：
Ca = 12.72A663 – 2.59A 645 （3）
Cb = 22.88A645 – 4.68A663 （4 ）
将 Ca 与 Cb 相加即得叶绿素总量 CT ：
CT = Ca +Cb =20.29A645 + 8.05A663 （5）
另外，由于叶绿素a、b 在652mn 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（A652）而求出叶绿素a、b 总量：
单位 mg/L（6）
在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了80％丙酮提取液中3 种色素含量的计算公式：
C a = 12.21A 663 – 2.81A646 （7）
C b = 20.13A646 – 5.03A663 （8）
C x =（1000A470 – 3.27Ca – 104Cb）／229 （9）
式中：Ca、 Cb ——叶绿素a和b 的浓度。
Cx ——类胡萝卜素的总浓度。
A 663、A646 和A 470 ——叶绿体色素提取液在波长 663 nm、646 nm 和 470 nm下的消光度。
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素 a、b 在95％乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665nm 和 649nm ，类胡萝卜素为470nm ，可据此列出以下关系式：
C a = 13.95A665 – 6.88A649 （10）
C b = 24.96A 649 – 7.32A665 （11）
CT =18.08 A649+ 6.63A665 （12）
C x = (1000A470 – 2.05Ca – 114Cb)/245 （13）
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
新鲜植物叶片（或其他绿色组织）。
（二）试剂
95 ％乙醇（或 80 ％丙酮）；石英砂； 碳酸钙粉。
（三）仪器设备
1.分光光度计，2.研钵 1 套，2.剪刀1把，3.玻棒，4.25 mL棕色容量瓶3 个，5.小漏斗3个，6.直径7 cm 定量滤纸，7.吸水纸，8.擦镜纸，10.滴管，11.电子天平（0.01 g 感量）。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品 0.3 g ，共 3 份，分别放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉及 2～3 mL95% 乙醇（或 80% 丙酮）研成匀浆，再加乙醇 10 mL ，继续研磨至组织变白，静止 3～5 min 。
3. 取滤纸 1 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25mL 棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25 mL ，摇匀。
5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665、649 和 470 nm下测定消光度。
6. 按公式10、11、12（如用 80％丙酮，则按公式7、8、9）分别计算叶绿素a、 b和类胡萝卜素的浓度（mg/L），10、11式相加即得叶绿素总浓度。
四、结果计算
求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿体色素的毫克数表示）：
叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重
或按上述公式分别计算叶绿素a、b的浓度及总浓度后，再按下式计算叶绿素在叶片中的含量：
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