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标题:【求助】请教肿瘤干细胞成球

vcve[使用道具]
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【求助】请教肿瘤干细胞成球


看了一些资料及参考了一下各位的经验,但还是有些问题不是那么了然,现总结一下,望各位不吝赐教,多批评指正。
关于贴壁细胞的成球实验
目前看老外都是按上面的方法直接分选干细胞放在无血清培养基、超低粘附培养皿中进行培养,但也有很多人也用细胞系做。所以请教一下如何诱导贴壁细胞的成球。
问题:(1)一般选择多大的培养皿,6孔板?
(2)接种密度?10000~100000个/ml还是说这个都要靠自己去摸索?有没参考密度?
(3)怎么换液?
A 看老外只是说一周加两次生长因子,我想那么高密度的细胞经过无血清培养肯定死一大片,这些死细胞不处理?
B 也有说人说直接添加培养基,营养是在一定程度上保证了但是仍然解决不了死细胞“污染”干细胞生存环境的问题。 也有说离心换液的,如果离心的话那还得再次吹打使细胞散开。这岂不是影响成球?? 好不容易成了一点球被吹散了,又得从头再来? 纠结???
D另外致密球和疏松球有什么分别,疏松球是不是假肿瘤干细胞细胞球,只是细胞的机械粘附???
E一旦成球后需要消化传代,请问现在大家都用哪种酶? 有用胰酶的也有用invitrogen的asscuate的,哪种好用?
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zbs[使用道具]
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首先不是每个细胞系都能成球的,一般来说恶性程度很高的肿瘤细胞才有可能。
1、培养皿可以选择6,12,24孔板,也可以选择100 mm培养皿。
2、密度需要自己摸索。低密度常用于元代肿瘤干细胞的提取,筛选可以非粘附生长的细胞。高密度用于细胞球的扩增,一般来说5000/ml以上。
3、一周加两次生长因子没有问题的。细胞球生长很缓慢,培养基中的FGF和EGF至少能够支持2周以上。不推荐直接添加的,确实会影响细胞质量。
细胞球传代需要用弱的消化酶,我使用的是TrypLE Express。据说Accutase和Dispase也可以。
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duchy[使用道具]
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有的恶性程度高的细胞系是很容易成球的,但有的细胞系很困难。
我用的方法是可以定期加入含生长因子的培养基,离心换液。
有的细胞球很不容易吹散,有的很容易,要摸索。
如果细胞球相对比较纯之后,就算打散了还是非常容易再形成的。
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这是我用的肿瘤干细胞培养基配方,供大家参考,应该会对你的成球实验有所帮助:
cancer stem cell media (serum free)
500ml DMEM/F12+Glutamax include:
一、1%P/S (双抗)
二、1% Sodium pyruvate(丙酮酸钠)(加5g)
三、1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X) (invitrogen)(加5ml)
四、1% Insulin-Transferrin-Selenium-X Supplement(ITS) (100X)(invitrogen)(加5ml)
五、1uM dexamethasone(地塞米松)五五((((
六、200uM L-ascorbic acid 2-phosphate (sigma aldrich) (加28.954mg)
七、10mM Nicotinamide (尼克酰胺) (sigma aldrich) (加 610.6mg)
以上配好后可以在4度长期保存,每次用时的配方如下:
add fresh per 50ml media( cancer stem cell media),每50ml 上述配好的培养基,加入:
1. 20ng/ml EGF(加10ul EGF(100ug/ml))
2. 10ng/ml FGF-2( 加5ul FGF-2(100ug/ml))
每三天换液。
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我觉得你的问题很好啊,就是我像问的问题。死细胞污染的问题,换液的问题。请问你解决了吗?你是怎么做的呢?结果怎样?我的是第二天培养基就有点浑了,贴壁已经有很多凋亡了,有少许飘着,我直接在里面加了些培养基。
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你提的问题很好呢,如何去掉上清中的死细胞呢,我想问一下,你已经解决了没有啊?
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楼主,你得到答案了吗?
我也在养肿瘤干细胞,能得到你的联系方式吗?QQ号码,电子邮件或电话均可
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misswu61[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 DDD 于 2015-10-19 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主,你得到答案了吗?
我也在养肿瘤干细胞,能得到你的联系方式吗?QQ号码,电子邮件或电话均可

想请教你曾经的这个问题解决了吗、 我现在正在做这个 ,不知道怎么换液
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想请教你曾经的这个问题解决了吗、 我现在正在做这个 ,不知道怎么换液
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vcve[使用道具]
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我使用的是六孔板,用半量换液法,就是用吸管吸出一半,再加一半;待有球行成后,可低速离心后换液,形成的球一旦进入生长轨道,还是比较容易存活的。
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