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标题:【分享帖】自己总结的MTT方法原理

mogu[使用道具]
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【分享帖】自己总结的MTT方法原理


一、  原理
黄色的噻唑兰,简称MTT,可透过细胞膜进入细胞内,活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中,结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映细胞数量。
二、实验步骤(实用于贴壁细胞)
1)收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,分于96孔板,每孔180μl,3000-10000个/孔。
2)置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁,培养6-24小时。
3)加入待筛样品20μl,继续培养44小时。
4)小心吸去上清,加入80μl新鲜RPMI 1640培养液,再加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。
6)然后吸掉上清,每孔加入150 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7)  同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
8)  计算抑制率=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.
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jude[使用道具]
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有依据吗?或者来源?
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seagate[使用道具]
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我用MTT作药物的增值情况,看过楼主的也想写一些。
1.文献很多用470nm作为测定波长,也有用双波长来测定。我用双波长测吸光值。
2.加入待筛选样品后的培养时间最好也自己考察,每种样品的作用情况都不一样,我的样品就是在加药48小时时最佳。
3.关于调零孔:二甲基亚砜遇光不稳定,变黄。楼上说低速振荡10 min是否在蔽光状态下操作?本人试过加完培养基、MTT,吸尽溶液后,再加二甲基亚砜,分别于2-3min,和15min时于双波长下测吸光值,发现值分别大约为0.05,0.3,差别大,而样品孔变化有细微差别不大。不过我用的是国产的,国外产品没测过。我想应尽快测。能自己考察一下测定时间最好。
另外,二甲基亚砜会腐蚀微量取样器,用时小心别再沾枪身上,我已经被二甲基亚砜弄坏一把微量取样器了。
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Darcy[使用道具]
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“对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)”中“相同浓度的药物溶解介质”是什么东东啊?能帮忙解释一下吗?
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49888[使用道具]
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指溶解药物的溶剂,比如样品使用乙醇溶解,即指乙醇。
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duchy[使用道具]
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如果用二甲基亚砜溶解药物的话,还能加20ul么?二甲基亚砜不是对细胞也有毒性么,看文献说不能超过0.5%的,那要加多少合适呢?
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seagate[使用道具]
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我最近也在做MTT,每次做3个复孔,因为做时间依赖,每次用一块96孔板,是不是太浪费了,有没有好的办法?
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ero11[使用道具]
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MTT感觉不如cck-8方便
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zhenxin[使用道具]
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相关疾病:
MMT的效果确实不错,重庆医科大学已经做了很多。
如果对MTT有疑问,可以参考最近出版的《现代肿瘤学基础》。这本书对MTT用于检测细胞生长和肿瘤药物筛选有着详尽的表述。
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hyuu[使用道具]
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我也正要做,还不是明确步骤。
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