请PCR内行看看primer设计的问题

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 请PCR内行看看primer设计的问题

13 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:请PCR内行看看primer设计的问题

purrr[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72864
精华 0
积分 362
帖子 384
信誉分 100
可用分 2786
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2011-9-20 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请PCR内行看看primer设计的问题 [转载]

我现在的实验需要扩增各种细菌的基因片断，因此要设计大量的primer。

我查阅了一些primer设计的资料，发现推荐的primer长度多是18－27bp；例如《分子克隆3》上推荐的长度是18－25bp。

这个数字源于统计学上的概率计算（比如：4的17次方是17179869184，超过人类基因组的5倍，如果碱基在基因组中随机分布的话，则17bp的primer只可能在该染色体上有一个接合点）和密码子使用的偏爱性的考虑。

我的问题是：原核生物的基因组远小于人类，如e.coli约4639kb，那么依据以上的引物长度计算方法，我在设计primer的时候是不是可以把它的长度缩减为，比如说：13－16bp？

谢谢。

P.S
4的11次方是：4194,304－－－接近4639kb
4的12次方是：166777,216－－－超过4639kb
4的13次方是：667108,864－－－远大于4639kb

喵咪[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71749
精华 0
积分 338
帖子 455
信誉分 100
可用分 2961
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态离线

发表于 2011-9-20 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

primer的特异性是引物设计的一部分，还要考虑Tm值，太低对PCR反应不好

queen[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72228
精华 1
积分 361
帖子 337
信誉分 102
可用分 2571
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态离线

发表于 2011-9-20 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

依据《分子克隆3》page：607 （译本）上提供的，计算一条oligo与一条线性的，随机排列的，DNA序列中的任一段完全配对的概率公式，可以知道：对于13bp的oligo，大约每4的13次方（即：667108,864bp－－远大于4639kb ）才会有一个结合位点。
所以－－对于4639bp的e.coli，13bp的primer应该足以保证与e.coli染色体只有唯一个完全的结合位点。

另外，由于退火温度由Tm决定，一般设为Tm减去5度，如果设得太高或者太低都不利于pcr反应。引物的Tm值本身应该不会对pcr反应有影响吧。

我要是说得不对请大家指正。

queen[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72228
精华 1
积分 361
帖子 337
信誉分 102
可用分 2571
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态离线

发表于 2011-9-20 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是大家都一致同意我的观点？

邓布利多[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 72020
精华 0
积分 131
帖子 42
信誉分 100
可用分 891
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态离线

发表于 2011-9-20 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不同意，哈
按照你的计算方法，当然特异性是没有问题，但在实际反应中，也许13个BP不一定全部结合到漠板上，只要3‘端大部分或部分结合到漠板上可能就可以反应，这种情况下，嘿嘿...
有没有这样的经历，20多个BP去BLAST仍然有同源性很高的序列
我也说的不一定对，请大家指正。

碧空子[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 73209
精华 0
积分 127
帖子 34
信誉分 100
可用分 861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态离线

发表于 2011-9-20 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物的长度多少合适，我认为很难说，我用过长度最小的引物是16个bp，最长40个bp的引物，扩增的都是人的基因组DNA，效果也都不错。所以我认为，理论上说的通只是其中的一个方面，关键还是要看具体的要扩增的序列的情况。另外，Tm值是一个很重要的参数，引物的Tm值和扩增产物的Tm值相差太大会给扩增带来一定的困难，有时甚至就很难做好，但是，也不尽然，我扩增过二者Tm相差24点多度的PCR，也能扩出很纯且产量很高的产物。所以，我认为，只有实践一下才知道倒底行不行。当然，我并不是否认理论对实践的指导作用，我这么说的意思是：理论来自与实践，还是有很多地方需要实践去检验和完善的。

@花开花落@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71290
精华 1
积分 267
帖子 250
信誉分 102
可用分 1986
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2011-9-20 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
　　②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
　　引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

@花开花落@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71290
精华 1
积分 267
帖子 250
信誉分 102
可用分 1986
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2011-9-20 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
　　温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

@花开花落@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71290
精华 1
积分 267
帖子 250
信誉分 102
可用分 1986
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2011-9-20 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

@花开花落@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71290
精华 1
积分 267
帖子 250
信誉分 102
可用分 1986
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2011-9-20 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

关于PCR的非特异性条带
PCR过程中往往存在非特异性条带，是一个很让人烦恼的问题。最近RACE有了一点新的idea：
首先我们来分析PCR过程中非特异条带的来源是什么。有几种可能：
1、上/下游引物在目标基因其他位置的错配
2、上/下游引物在非目标基因上的错配
3、单引物在非目标基因或目标基因上的错配
如果出现第1种情况，则其片段大小是不一样的，很容易将其与目标片段区分开来；
如果出现第2种情况，则可有意思，也具有研究价值，其意味着在另一个基因上，同时存在上/下游引物的相似序列。应该注意的是存在单上或单下游引物的相似序列是可能的，但其不能完成PCR所需的条件，无法扩增出片段。同时存在着上/下游引物的相似序列区，表明非目标基因与目标基因存在很大的相似性，可能具有同源性，在进化研究上具有重要意义！
第3种情况是最令人讨厌的了。而且其扩增出的片段往往可能与目标片段大小相似，容易让人产生误解，我已经成功扩增出了目标片段，然后回收、连接、转化，测序或进入下一步工作，费钱费时费力费神！
因此，我现在通常在PCR条带很不错，准备进入下一步工作之前。再做一次verfiy PCR。三个管，分别是：A，上/下游引物、B，单上游引物、C，单下游引物。
A中出现的条带而在B、C中没有，表明这个条带的DNA为只有上下游引物同时存在时才能扩增的，如果片段大小相似，则肯定为所需条带。如果大小差异很大，就看你的兴趣了！说不清楚可能会有什么发现哦！
如果A中的条带B或C中也有，显然不是你要的东东！
还有一个问题：B和C中的条带并一定会出现在A中。我曾做这样一次PCR， B有很多非特异条带，C也有很多非特异性条带，而A却只有2条带，一条为目标片段，一条为B中的非特异条带。

13 1/2 1 2 ››