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标题:如何提高PCR的扩增效率？我的模板量很小

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发表于 2011-9-20 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如何提高PCR的扩增效率？我的模板量很小

如何提高PCR的扩增效率？我的模板量很小



如题。请高手指点！
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以换上TAKARA或QIAGENE的酶试试,还有就是做一个Mg2+浓度梯度,看看在什么浓度它的扩增效率最高,还有就是你样品的纯度了,纯度高扩增效率应该有所改善,如果序列很短你就用两步PCR咯,这是我的浅见,但愿有用  
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以用巢式PCR进行扩增，可以在一定程度上提高PCR的效率，并且效果还是比较明显的。当然你可以试一试先用随机引物做一个预扩增，然后将预扩增产物用做模板再用你的引物进行扩增，我想如果你要扩增的片段不是很大的话，应该也是有效的。
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不懂[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
nestde PCR
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发表于 2011-9-20 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以加大dNTP浓度，在不影响扩增的条件下，适当降低退火温度。一般能解决，当然稍微加大酶量也是起作用的。  
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8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果模板量很少，可以用PCR产物做模板，再次扩增后切胶纯化。
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你是否知道你的片段大小？如果知道，就比较简单！ｐｃｒ结束后，电泳时，你用ｐｃｒ产物和ｍａｒｋｅｒ作比较，找出目的片段，切胶后，不必像楼上所说的取纯化，直接浸泡到５０ｕｌ ＴＥ里，过一两天，这些溶液就可以做模板
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发表于 2011-9-20 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有了足够量的模板，可以作优化，用软件设计优化实验方案，很快就能找到最佳的Ｍｇ２＋等各项参数的最佳值，提高PCR的扩增效率！
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911[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家的意见！我想我写的太笼统了！我是用两对引物进行巢式扩增，由于扩增的序列含量很小，所以第一次扩增是看不到电泳条带的（文献中就是这样，我做的也基本上是这样），第二次扩增有一条300bp左右的条带。我的阳性对照已经有了，也很稳定，条带也很强，但是实验的模板量却很少，看到这个版里面前人的经验，我把两轮引物浓度都已经调到最低了，最后能够得到一个阳性条带，但是比较弱－－比引物二聚体弱，当然引物二聚体是偏强的那种。我第一轮产物是500bp左右，我是用的都30s，复性温度60，是根据文献来的，第二轮我把延伸温度改从30s改成了18s。看到大家建议我降低复性温度，我不知道有没有效果。因为我感觉我主要的问题似乎是引物二聚体。谢谢大家的帮助！
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雪花子[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有了足够量的模板，可以作优化，用软件设计优化实验方案，很快就能找到最佳的Ｍｇ２＋等各项参数的最佳值，提高PCR的扩增效率！

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用什么软件设计优化方案啊？
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