mRNA直接PCR能扩增出产物吗？

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标题:mRNA直接PCR能扩增出产物吗？

月牙牙[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

mRNA直接PCR能扩增出产物吗？ [转载]

如题：mRNA不经反转录而直接PCR从理论上似乎行的通！
可是实践中能成功么？愿闻君高见！

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先告诉你一个铁的实事，就是mRNA不经反转录而直接PCR无论从理论上还是实践中都绝对不行的。说句你不爱听的话，你这么说只能说明一点：就是你的生化和分子生物学知识还没弄懂。建议你找本书看看，先把理论懂，免得将来走弯路。
这里简单告诉你一个流程，就是mRNA必需经RT-PCR得到cDNA后才能PCR。

喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不可以，如果你的经费不足的话，可以用总RNA直接反转录，再做PCR。这样的条件刚做过，只是在加总RNA时量要增加，效果还不错，我的结果已送去测序。

春雨[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Taq 酶是DNA polymerase，是以DNA 为模版的 DNA polymerase。（反转录酶是以RNA 为模板的 DNA polymerase）

虽然写出来RNA 与 DNA 差得不多，但RNA 的五碳糖上是有-OH的，而DNA 的糖上是 -H，所以DNA 又叫脱氧核糖核酸。

#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这很有意思。从RNA到DNA是质变，而PCR过程只是量变，这里面必须要有一个因素来使之达到飞跃，就是逆转录酶。要知道PCR反应中的DNA聚合酶是只认得DNA模板的，没有RT过程提供第一条DNA，扩增无从谈起。你要是想在PCR过程中用一个只认得RNA模板的DNA聚合酶，那也有问题，因为总是只有母体的一条RNA做模板，无法形成双链，也没有办法大量扩增。除非找到一个同时认得RNA模板和DNA模板的聚合酶（当然还得符合PCR过程的苛刻条件），但这个过程如果聚合酶以RNA为模板合成了DNA, 其实也还是一个质变的问题，就是逆转录。

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个问题很有趣,因为最近我遇到这样的情况,也在思考中
我在测试一对引物时,设置共四个反应,1和2是两个不同个体的cDNA,3是一个个体的总RNA但是在和1,2一同逆转录时未加逆转录酶,也就是说3这个标本不含cDNA,只有RNA,4是阴性对照(用H2O),结果,1,2为阳性,4为阴性,这和预期一样,奇怪的是3也是阳性,在电泳图中可以清晰看到和1,2大小相同的PCR产物,只是比前两者的量低(且实验过程中肯定没有污染),为此特地买了RNase,将3标本用RNase消化后,继续重复上述PCR,结果,3的条带消失了.所以本人以为mRNA也有直接被扩增的可能,但是从理论上讲THIS IS MISSION IMPOSSIBLE
不过可惜的是我没有将那个扩增产物进行测序,否则则更加结果明确.
不知道是否楼上XDJM中有人也对未加逆转录酶的RNA直接做过PCR扩增?

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

所以本人以为mRNA也有直接被扩增的可能,但是从理论上讲THIS IS MISSION IMPOSSIBLE

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这个小实验挺有意思。不过结论还没有听说过排除了DNA污染，能否就你的实验排除有逆转录酶污染呢？如果不能，那做这个结论是否有点早。呵呵，讨论讨论

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“兄弟的实验设计不够严谨^_^。

估计导致3是阳性的原因是存在genomic DNA污染，这在total RNA中很常见，祛除污染可以用RNase free的DNase处理。设计RT引物时最好考虑跨内含子，以此来区分污染引起的条带。

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

设计的引物是在不同的外显子区域,所以如果扩增的是GENOMIC DNA则其片段长度必然远远大于目前的长度(包含内含子),而且内含子有10K以上,基本无法扩增出产物
其次逆转录酶污染也可以排除,而且如果有污染而合成了cDNA,那用RNase处理后应该依旧有扩增条带,而现在没有
所以说结果非常奇怪,到底这个PCR模板哪里来的
请大家讨论讨论,非常有趣

胖小妮子[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

又在网上找了一下，好象没有提出RNA可以做 DNA polymerase 扩增模板的说法。我们看来还是要在污染上找一下原因了。

如果你的的RNase 有少少量DNase 污染呢？

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