PCR 的可重复性

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标题:PCR 的可重复性

过路甲[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR 的可重复性 [转载]

最近两个月来，一直在做PCR，以至做的要吐血：我要分析一条基因的组织分布情况，用自己反转录的CDNA，PCR后，电泳，可得到极亮的条带，且重复性很好。但是，用公司的试剂盒（含十六种组织的CDNA）做了两次，一次都没做出来（做一次，就是几百元人民币），而别人用同样的试剂曾做出过，现在钱没少花，实验也没作成，没法给老板交差，我简直郁闷死了。
老天，帮帮忙！

guagua[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但是，用公司的试剂盒（含十六种组织的CDNA）做了两次，一次都没做出来（做一次，就是几百元人民币），而别人用同样的试剂曾做出过

===========================================================================================================

我不知道你提到的试剂盒（含十六种组织的CDNA）是只提供cDNA呢还是也提供PCR试剂？你可以先扩GAPDH或actin看是否能出来，如果能出来，至少说明cDNA还有效，你就应该改变PCR条件再试试

过路甲[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试剂盒是roche(罗氏)公司的，带有beta-actin内参，能扩出来，cDNA没问题。
刚做是时，我自己反转录的cDNA也扩不出，于是就想办法：基因特异引物我换了两条，pcr 退火温度我从44度试到60度，Mg+离子浓度我做过梯度……各种条件我都尝试过，结果是现在我可把自己反转录的cDNA扩的很亮，但就是扩不出公司的。二次PCR我也试过，没有效果。我不知到为什么重复不出来，现在，搞的我怀疑一切：PCR仪器的效率不稳定，PCR反应产物降解，电泳，加样手法，理论
……我都快受不了了。
还望高手指点迷津！！！
在此有礼了！

冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

跟公司的技术支持联系看看

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“带有beta-actin内参，能扩出来” 和 “结果是现在我可把自己反转录的cDNA扩的很亮”
这两个PCR体系是否一样？

顺便问个问题：
物种没搞错吧。比如 human 和mouse 的cDNA 和引物是不能混用的。

何去何从[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的情况跟我类似,我前2个月扩几条基因,总是不稳定,有时能扩出来,有时则不能,包括GAPDH，因为我很信任promega的RT_PCR试剂盒，但不知冰箱曾断过电。后来干脆重新提取RNA，在新买了一个试剂盒，OK！重复性也可以。所以我想你的问题可能也是由于cDNA模板有问题，也就是试剂盒中的cDNA可能有问题,可以找公司咨询鉴定一下是否过期.
希望能有启示.

过路甲[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用的是同一个PCR体系。我做的是人各种组织的cDNA。

更正一下，我用的clontech （而不是roche(罗氏)公司）的试剂盒，包括人十六种组织（心、脑、脾、肺、肾、肝、前列腺、骨骼肌等）的cDNA。一个盒子是8000多元，并且师兄用该试剂盒做另外一条基因做出来过，买新盒是不可能的。

另外，我尝试过二次PCR，效果也不好。我考虑加入PCR促进剂，请教各位还有还有可行的操作办法，以增加PCR的产量。
真诚的希望得到您的帮助！

#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“ 用的是同一个PCR体系。” 还有个问题，PCR体系是做mix后加不同模板吗，我只是想确认一下PCR体系是对的，因为只有是mix,同时PCR才能真正反映出来。
“我尝试过二次PCR，效果也不好。” 是有时能出来吗，还是一次都没出来过。
但从你的描述我看是kit里的cDNA没有你要的基因。
再问个问题，你的实验目的是什么？是RACE吗？

丸子妹[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

内参因为含量很高，所以很容易P出来，所以我怀疑你的试剂盒的cDNA 有问题。因为同样的条件能够扩出来你自己的模板。还是找公司再问一问吧。另外在P一把你的cDNA,看是否有重复性，有时有污染的cDNA在其中，而你扩出来的片段虽然大小符合也可能是巧合，并不是你的目的片段。

过路甲[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢搂上两位
PCR是MIX后加摸板的。二次PCR结果是阳性质粒对照，扩出来了，目的条带没有。我是实验目的是分析一条新基因在在人体各组织的分布情况。

污染不可能，因为我反转录过几次最少三种组织都扩出来过。
淡然该基因的表达丰度低是有可能的，KIT中该基因的量低于我所转录的CDNA也是有可能的。

我现在尝试做SOUTHERN杂交。

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