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标题:跑了个PCR和电泳，结果内参和目的基因都出现了引物二聚体

wiwi[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑了个PCR和电泳，结果内参和目的基因都出现了引物二聚体

今天跑了个PCR和电泳，结果内参和目的基因都出现了引物二聚体，不知道哪里出了问题？请高手指点一下，谢谢
1、提RNA时加入了1毫升的TRIZOL，有人说太多了，请问高手TRIZOL多了的话会不会有影响？有什么影响呢？
2、提完RNA后，加入了20微升的DEPC水，是不是少了？因为我用这个去cDNA合成时，发现很粘稠，这又说明了什么呢？
3、Taq酶我加了0.5微升，镁离子是和buffer混在一起的（别人用此跑出来过）
4、我的PCR条件：
hold 94度 3m
cycle 94度 40s 55度 40s 72度 60s 28次
hold 72度 5m
hold 4度 10s
hold 4度 forever
说明一下：我的引物（包括内参）浓度是没问题的，别人跑出来过
谢谢，急


[ 本帖最后由 miracle 于 2011-9-21 10:44 编辑 ]
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发表于 2011-9-20 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 不需要那么多的TRIZOL，我一般100uL的血清中放入TRIZOL300uL就够了。不过，要充分摇匀，使蛋白降解。
2. DEPC水够了，我一般只用10uL溶解。你的会那么粘稠，我觉得可能混入了其他的东西。
3. 我觉得首先是你的RT-PCR技术是否熟练。若你认为你的技术没问题的话，我建议你重新泡离心管和枪头，用新的异丙醇、氯仿等试剂，包括DEPC水。
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wiwi[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还想问一下：cDNA合成之后PCR前，产物需要稀释吗？我有同学说稀释一倍再PCR，cDNA浓度太高不易跑出来，有这说法吗？
谢谢你了
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发表于 2011-9-20 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的PCR体系是多少微升的？是100微升的吗？建议你做体积小点的，不然太浪费。你的RNA测了OD值没有？如果不测一下所有的RNA都去做RT，浓度过高的RNA会抑制RT过程哦！
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发表于 2011-9-20 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的PCR体系是多少微升的？是100微升的吗？建议你做体积小点的，不然太浪费。你的RNA测了OD值没有？如果不测一下所有的RNA都去做RT，浓度过高的RNA会抑制RT过程哦！

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RNA没测OD值，因为仪器坏了，我是估计了一下，用了3微升
PCR体系是25微升
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庄梦蝶[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该不需要吧，反正我从来没稀释过。
你可以都试试看。
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米米[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问胶对电泳有影响吗？
我的胶偏厚，浓度是2%，是前一天配的
不好意思，昨天有一点忘记说了，我是内参和目的基因均出现了引物二聚体
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豆荚[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是25微升体系，我不知道你的taq酶是不是和我的一样是5u/ul,如果是的话，你的taq酶用的太多了！只要0.1ul就够了。太多的taq酶也会产生你不想要的结果
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豆荚[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是25微升体系，我不知道你的taq酶是不是和我的一样是5u/ul,如果是的话，你的taq酶用的太多了！只要0.1ul就够了。太多的taq酶也会产生你不想要的结果
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鲁西西[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你做的胶可能会使得图象不清楚，但不会影响实验结果。
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