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标题:请教touch down

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发表于 2011-9-20 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教touch down

请教touch down [转载]


比如我的程序是55度条带最好。
那么：
1。 我如何选择touch down 的范围
2。 touch down 的原理是什么。为什么要用touch down呢。我感觉从原理上好像用处不大啊。

谢谢
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发表于 2011-9-20 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
简而言之，“touch down” PCR 是一种寻找最佳复性温度的方法。

它是用“热循环PCR仪”在连续的循环中逐渐降低复性温度的方法来确定最适Ta，所以只用一次PCR就可以确定最适Ta值，避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化与测定工作。

也就是说，一次就可以搞定。
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发表于 2011-9-20 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是我看很多关于DGGE的文献，并不单单是为了找到一个好的条件后就用这个条件来P,而是一直用touch down来扩增环境DNA.清继续指教。谢谢了。
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发表于 2011-9-20 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
运用touch down PCR的主要目的是增强PCR扩增的特异性.我在实际应用中一般采取step down的程序.以55度为例,可从60度down到52度,每一cycle down 0.5度,然后,52度作20 cycle.
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发表于 2011-9-20 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你已经知道你的程序是55度条带最好，你就完全没有必要去考虑touch down 。touch down 的原理是通过一系列的递减退火温度(其中一定要包含你的最佳退火温度)来得到你一轮PCR扩增产物，然后再用一个低于你最佳退火温度的退火温度来做后续的扩增，从面得到你所需要的产物。
这种PCR是在你知道你的PCR的退火温度的大概范围，又不想去仔细摸索最佳退火温度时用，通常情况下可以得到你所要的扩增产物。
以上见解供参考。
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发表于 2011-9-20 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是那为什么好多文献都是一直用touch down来扩增环境DNA. 好像他们的意思是为了得到更多类型的产物。比如说，环境样品中一共有10种dna,按照最佳的pcr应该可以扩增出来10种产物（虽然是同一个大小），但是大家都知道不可能，也许用普通的pcr 只能扩增5种产物，如果用touch down也许可以扩增出8条，就是说可以扩增出来的“种类”增加了。请问是不是呢。如果是，那原理是什么呢。谢谢。
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发表于 2011-9-20 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
退火温度降低,引物和模板特异结合能力减弱,从而给其他模板提供了结合的机会
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云端ing[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像也不是啊。touch down 的范围一般是在普通pcr退火温度的上面10度啊。好像目的是为了给退火温度高的模板机会一样。
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发表于 2011-9-20 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的touch down 就是用来增加特异性，因为摸索最佳温度很麻烦。
我较懒，所以一般都是touch down 进行pcr
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pou[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
比如Tm62度，先65到50度做每两个循环降低一度的反应
这就是30个循环，在50再做15个，45个循环。

TD PCR要做那么多循环，如果用常规量的酶，引物等成分，会不会不够？
需要加量吗？标准是什么？
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