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标题:关于VEGF的RT-PCR

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发表于 2011-9-20 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于VEGF的RT-PCR

关于VEGF的RT-PCR [转载]


我做正常人血液中单个核细胞VEGF的RT-PCR，已经做了快两个月了，但结果都是一样的：内参非常好，VEGF基因不表达。我已经用梯度PCR仪改了不少条件，但还是没有结果。我用恶性肿瘤的细胞株做就能出结果，不知道是不是课题本身有问题：正常人血单个核细胞不表达VEGF？查了文献，众说纷纭，有些人说正常人不表达，有些人做了表达率竟然高于80%，不知我的做法是否有问题，还是真的不表达？真想现在就放弃！望有人能够帮助我解决问题。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
既然恶性肿瘤细胞株能做出结果，至少可以证明你的实验本身问题不大。很有可能正
常人VEGF表达很少或者不表达。而且文献上众说纷纭，说明这个问题还存在着疑问。
如果VEGF表达很少，也可以检测不到，你可以试试增加细胞数，继而增加CDNA的量，
看看能不能出来。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
试一试增加循环数。
我也做VEGF及其受体KDR,Flt-1的检测,但我也没有作过单个核细胞，但对KDR的检测因为表达水平比较低，通常循环数都比较高，加上预循环，甚至可以达到45个循环。
我想这可能也就是对表达比较低的基因，文献报道众说纷纭的原因之一吧。
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发表于 2011-9-20 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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发表于 2011-9-20 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
准备重提一批RNA，增加细胞数，增加循环次数再试试看。不过，我现在想起来，平时我就把上下游引物、水、10*PCR buffer、dNTP以数倍体积混合配好备用，不知会不会影响结果？
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发表于 2011-9-20 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参非常好，VEGF基因不表达。

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第一RNA质量过关吗？你把RNA的电泳图贴出来看看。”内参非常好“，我想你的标准是它能放出来。能放出来不代表你的RNA质量一定是好的，因为内参表达量都是很高的，RNA质量不是很好也能放出来。
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发表于 2011-9-20 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
明天我准备重提一批RNA，增加细胞数，增加循环次数再试试看。

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如果你以前的RNA是好的没必要重提RNA。你可以在PCR时加大模板量和cycle.如果你认为模板太稀可以再做次RT，一般2ug total RNA/100ul.
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
平时我就把上下游引物、水、10*PCR buffer、dNTP以数倍体积混合配好备用，不知会不会影响结果？

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这种做法是不好的，因为你把水都含在mix里就无法调节模板量了。mix不能算上水
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qqq111[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你认为模板太稀可以再做次RT，一般2ug total RNA/100ul？什么意思？
因为前一段时间VEGF一直跑不出来内参能跑出来，我现在换了promeger的Tag酶，换了一台梯度PCR仪，竟然跑出4条条带，分别是200多300多600多bp，可不可能把VEGF的四个亚型都跑出来了？是不是需要到genebank上把我这对VEGF的引物重新BLAST一下，并且看一看是否这对引物之间存在着外显子，有些表达，有些不表达？
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你认为模板太稀可以再做次RT，一般2ug total RNA/100ul？什么意思？

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意思是如果做100ul体系RT加2ugRNA足以，其它体系等比例调整RNA用量
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