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标题:请教两步PCR?

HOT兔[使用道具]
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请教两步PCR?

请教两步PCR? [转载]


两步PCR怎么做,情况下用这个方法?其优缺点是什么?
烦劳高人告知!!!
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purrr[使用道具]
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标准的PCR过程分为三步:

  1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA

  2.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

  3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。

  每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量可增加一倍(理论上)。

两步PCR其实就是将退火及延伸的温度设置在一个温度上
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的
时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃
间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。.
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8黑眼圈8[使用道具]
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我的实验的退火温度是62度左右,也能用这种方法吗?
那具体的程序是怎样的?
退火和延伸时间要多少呢?
谢谢!!!
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嗨皮[使用道具]
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关键看你要扩增的目的基因的长度是多大了!
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嗨皮[使用道具]
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关键看你要扩增的目的基因的长度是多大了!
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HOT兔[使用道具]
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我的目的基因229bp,你看行吗?
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#甜#[使用道具]
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100~300bp是可以的!! 2min试试。
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babybabe[使用道具]
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改善一下条件吧,方法上肯定是可行的!!  
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了了[使用道具]
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楼主这名字好熟悉啊,
2 步法很少用的,因为经典的3步法就能解决的啊
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喵咪[使用道具]
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常规PCR一般都是三步法,但用探针技术可以用两步法,如果不是用探针的话最好三步法。不知道你使用定量方法还是定性方法,如果定量的话,最好保持在200bp左右。  
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