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标题:为啥我rna总是降解？

爆炸头[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为啥我rna总是降解？

为啥我rna总是降解？[转载]


我用试剂盒抽提细胞株时很好，但在抽提组织标本时却总是降解，跑不出条带！
我抽提的是胃粘膜组织，获得标本后迅速放入液氮保存，先后保存时间大约有1~2年。抽提时先室温下解冻标本，剪取50mg，用剪刀剪碎后加入变性液在匀浆器中匀浆，后按说明书进行。请各位老师指点，问题出在哪里！
我没有碾钵，不能在液氮里碾碎！
头大死了！
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发表于 2011-9-21 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问题出在“室温下解冻标本，剪取50mg"，这一步一定要快，否则容易激活RNA酶。你可以在取得标本时立即用消毒的剪刀把标本剪成大约50mg的小块，提取RNA时在液氮里研磨，然后迅速倒进有裂解液的匀浆器中。其实我经常不匀浆，用枪吹打，再用一次性10ml注射器吹打，一样可以。具体的方法你可以参考《分子克隆》  
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911[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问题出在“室温下解冻标本，剪取50mg"，这一步一定要快，否则容易激活RNA酶。你可以在取得标本时立即用消毒的剪刀把标本剪成大约50mg的小块，提取RNA时在液氮里研磨，然后迅速倒进有裂解液的匀浆器中。其实我经常不匀浆，用枪吹打，再用一次性10ml注射器吹打，一样可以。具体的方法你可以参考《分子克隆》  
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发表于 2011-9-21 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没必要解冻后称量，用同样组织做样本称量50mg，按他的体积估计一下你的样本取适当直接液氮研磨。
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爆炸头[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果不用碾钵行吗
我是剪碎后利用匀浆器打碎的
我已收集了一百多份标本，该如何抽提啊！同事告诉我，一般最好新鲜标本就抽提，否则冻存后标本一样会降解的，是这样吗？我可是已经冻了1年了呀！
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blueeye[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样本应该没有问题的，我们实验室放－70度冰箱的组织，放了有几年都没有问题。抽提组织的RNA的时候是可以用匀浆器的，我都是这么做的；匀浆的时候也可以放在变性剂中匀浆。严格的讲，你剪组织的剪刀应该处理一下，可以用稀碱泡一下。
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爆炸头[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的剪刀用depc处理过的，应该没问题的！
还有，如果剪刀、镊子不用depc处理，在火上烧灼后再用depc水擦拭，我想不会有问题吧。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题出现在“抽提时先室温下解冻标本，剪取50mg，用剪刀剪碎后加入变性液在匀浆器中匀浆”，可能花去的时间较长，导致组织中的RNA降解。与其他的因素基本不相关。  
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庄梦蝶[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也认为问题是出现在"抽提时先室温下解冻标本，剪取50mg，用剪刀剪碎后加入变性液在匀浆器中匀浆”，可能花去的时间较长，导致组织中的RNA降解。与其他的因素基本不相关.样品如果保存在-80度左右,放几年没事.你可快速取出保存的样品,趁没解冻之前剪50mg,可不剪细碎直接匀浆.还有保证你提取的操作严格符合规范,防止RNA酶的污染.
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爆炸头[使用道具]
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发表于 2011-9-21 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我已改进方法，从液氮中取出标本，剪取50mg组织，迅速放入变性液中，再用剪刀剪碎，匀浆器匀浆。。。。。。
但近一月的标本抽提成功，之前的还是降解，倍受打击！
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