关于长片断PCR

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标题:关于长片断PCR

蚊子[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

关于长片断PCR [转载]

请问大家尝试过的最长片断的PCR有多长啊？
我想做3000bp左右的PCR，用高保真的DNA聚合酶，可是几次扩增出来的只有1000bp左右带，不知道什么原因。
我想知道在扩增长片断的PCR中，从DNA的提取到PCR的具体条件，有什么是要特别注意的吗？大家用过的有什么比较好的适用于这种长片断扩增的聚合酶吗？延伸时间要特别延长一些吗？我还应该调节些什么呢？

zhezhe[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我从文献上看到的最长的一次是30KB的一次PCR.自己扩的也不过才6000BP.
问题分析:1000BP很可能是非特意性的扩增.
建议:1,把你要扩的目的片段长度确定下来,以免扩出来了你还不知道.
2,高保真酶的聚合活性要比普通酶差很多,你的延长时间是否够了.要差一下你用酶的聚合能力是多少然后在确定延长时间.
3,如果延长时间足够,那么要看看你的退火温度是否合适,建议降低退火温度.(可能)
4,我用过TRATAGEN的PUF TURBO 1600元100单位.分子可隆上提过,算是VERY VERY GOOD的酶.其聚合活性是普通酶的2/5.
5,延长时间当然要长些了,如果是扩3000BP的话,延长时间大概在6分钟吧!!
6,你还要调节什么,俺就不知道列!!因为不知道你现在怎么做.不过好象其他的也没什么了!!
好运啊!!

不懂[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3000bp，太短了。用一般Taq即可扩增出。
在扩增长片段DNA的过程中，主要是所用的Taq酶和引物。按我的经验，扩增片段在4kb以下的，用TAKARA公司的rTaq没问题，但Pyrobest不能扩增出这样长的片段。扩增片段在3kb以下的，基本上进口的任何Taq酶均能较好扩增出，但国产Taq-plus和pfu可能不行。对于大于4kb的PCR，建议使用长片段PCRTaq，如TAKARA公司的LA-Taq，MBI公司的long PCR Enzyme Mix（#K0181）等。扩增保真性，如果以一般Taq为1，则长片段PCRTaq为2，Pfu为10。
引物也是一个重要的因素。引物Tm最好在60度左右，长度在20~25bp之间，千万不要请厂家设计引物，他们非常不负责，建议使用Primer premier5.0及以上版本设计。
延伸时间要足够长，一般按1min/kb延伸。
本人有较多的长距离PCR实践经验，最长扩增过12kb。有问题欢迎来贴继续探讨。

大虾米[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我有问题请教，我想扩增大约1300bp的片段，两条引物的Tm分别是：61.5度和64.7度，其退火温度最好是多少？变性、退火、延伸时间各用多少合适？还有，我用的是TAKARA公司的Taq酶，我准备用TUCHDOWN进行PCR，有人告诉我，在中途还要加酶，是否必要？请不吝赐教，谢谢！

purrr[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的Tm值是如何算出来的？是公司告诉你的还是自己算的？请告诉我你引物的长度和GC含量分别是多少？
如果你的Tm值计算是正确的话，退火温度用60度应该是合适的。
变性95度30″；退火60度30″；延伸72度1′30″。PCR体系可以按照Takara的说明书。按此条件应该能够扩增成功。
一般情况没有必要使用Touchdown，更无中途加酶之必要。
如果有梯度PCR仪，最好作一个梯度PCR，可以准确确定最适退火温度。
有问题我们继续探讨。

wiwi[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MBI的taq，50微升体系加0。5微升酶，扩5k的基因组单拷贝片段没问题
模板取了约100ng，CTAB法提的植物DNA
高保真酶扩长片段不利的原因参见stratagene关于PFU turbo和PFU ultra的说明
纯比扩增活力，clonetech的advantage系统应该算蛮好的了

wiwi[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大虾米[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢你的指点！十分抱歉，我记错了退火温度。我的引物是这样的：第一条：CCC（此为保护碱基）AAGCTT（此为酶切位点）TTATCGTTGTTGCCGTCGTT，公司给的Tm是64.9度，Primer premier5.0给的是59.1度（没有加保护碱基和酶切位点）；第二条：CAT（此为保护碱基）GCATGC（此为酶切位点）TCTTTGCTATCCTCCAAGTCCC，公司给的Tm是67.3度，Primer premier5.0给的是60.2度（没有保护碱基和酶切位点）。请指点我大致用什么PCR条件。谢谢！

花裙子[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

保护碱基和内切酶位点碱基在计算Tm时不予考虑。Primer premier5.0用于设计引物比较好，但给的Tm并不是十分适合于扩增。根据我的估算，你的两条引物Tm值相差较大（约为58℃和64℃）。GC含量分别为45％和50％，但下游引物有效长度为22bp（上游仅为20bp）。总的感觉这对引物不是十分理想，一般引物Tm值应该相差不能超过4℃。
建议你先按照我前面所说的条件试一试，如果不行建议你重新设计引物。
如果需要进一步帮助，欢迎再发贴探讨。

碧空子[使用道具]
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发表于 2011-9-21 17:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般加的酶切位点和保护碱基
我们算反应的时候均不考虑在内
该引物先用45度－55度的退火温度试试吧
不行就赞同楼上所言
从新合成

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