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标题:请大虾评价一下PCR体系

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发表于 2011-9-22 11:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请大虾评价一下PCR体系

请大虾评价一下PCR体系 [转载]


做PCR已经2月，没进展
今天PCR有产物，但条带不很清晰，位置在目标条带附近
请教反应体系和PCR条件有无问题？
10Xbuffer 2.5ul , MgCl2(25mM) 2ul, d NTP 1ul,premier 各1ul, DNA 模板5ul, Tag 1.5ul, 三蒸水 11ul
premier TM都是54。9度
PCR 94度 45S，53度 45S， 72度 45S，循环35次，72度延伸5分钟
非常感谢


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2011-9-22 11:37
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发表于 2011-9-22 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你这样写实在让人无从评价。
1. 详细列出你所使用的各组分的浓度或单位：如dNTP，Primer等等。
2. 扩增片段长度？
3. 最好不要贴这种缺乏美感的图片，好像与PCR无关
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发表于 2011-9-22 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起
d NTP 10mM 1ul,premier 各1ul 都是10uM
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发表于 2011-9-22 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的片段 294BP 用于定性研究，DNA差异大从0。35-1000多NG/UL
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发表于 2011-9-22 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
MgCl2浓度低容易导致产物量减少，可以试试如下体系：
10XBuffer 2.5 ul；
MgCl2（25mM）2.5ul；
dNTP（10mM）0.5ul；
Primer U（10mM）1.25ul；
Primer L（10mM）1.25ul；
DNA 250～500ng
Taq （5U/ul) 0.25ul
H2O up to 25ul

当然，退火温度也很重要，可以做个梯度pcr寻找最佳退火温度．最后延伸１０＇为好．
仅供参考，good Luck!
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发表于 2011-9-22 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
MGCL2可以1.5ul，2.0ul，2.5ul，3.0ul作个梯度试试；引物要那么多吗？我觉得0.4～0.6ul就够了。其余赞同楼上的。
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 小中大
MGCL2可以1.5ul，2.0ul，2.5ul，3.0ul作个梯度试试；引物要那么多吗？我觉得0.4～0.6ul就够了。其余赞同楼上的。
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发表于 2011-9-22 11:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的DNA一般都是300ng/ul以上，多的有3000ng/ul，用于定性研究必须按照
DNA 250～500ng吗？是否可以直接都用2-3ul，如果DNA含量高对反应有影响吗？盼答。谢谢大虾的点金。
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发表于 2011-9-22 11:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起
d NTP 10mM 1ul,premier 各1ul 都是10uM

===================================================================================================

如果你的反应体系是25ul，建议引物改为各0.5ul，镁2ul足以，最后延伸7分钟就可以了。如果TM为54.7退火温度就从50度开始好了。
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 小中大
10Xbuffer 2.5ul , MgCl2(25mM) 2ul, d NTP 1ul,premier 各1ul, DNA 模板5ul, Tag 1.5ul, 三蒸水 11ul
跑了退火温度梯度后用PCR 94度 45S，55度 45S， 72度 45S，循环35次， 72度延伸5分钟
但是用80V跑1。7%琼脂糖电泳，开始条带清晰，但半小时MARKER跑开后，目标条带成为带拖尾明显的宽带，今天调整Mg2+用1.5ul，2.0ul，2.5ul，3.0ul作个梯度，电泳还是如此。快晕了，急请教各位高手，非常感谢！！！
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