PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 求助：怎么老有引物二聚体 ？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 18  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:求助：怎么老有引物二聚体 ？

panda王[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72140
精华 0
积分 852
帖子 1444
信誉分 100
可用分 7919
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
1

发表于 2011-9-22 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：怎么老有引物二聚体 ？

求助：怎么老有引物二聚体 ？[转载]


我做RT_PCR有一段时间了，但是我怎么调Tm直，改变引物（已经设计了两对引物了）可是总有引物二聚体，我要的目的条带都没有，郁闷死了！！请大家帮我分析一下，是不是我得cDNA有问题，我在翻转之前没有测OD,只是跑了一下一般的琼脂糖电泳。有什么好的方法吗？
顶部
花裙子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70428
精华 0
积分 179
帖子 137
信誉分 100
可用分 1376
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
2

发表于 2011-9-22 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很郁闷啊，呵呵。
根据OD值，改变一下引物浓度，试一试会怎么样呢？
还有是不是引物设计有问题啊
顶部
@木木@[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70086
精华 0
积分 222
帖子 183
信誉分 100
可用分 1673
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-4
状态 离线
3

发表于 2011-9-22 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从头坐起吧！
rt-pcr不见结果一般都是 mRNA出问题！！
顶部
小鱼鱼[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73389
精华 0
积分 276
帖子 331
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
4

发表于 2011-9-22 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，你的RNA提取过关吗？建议提完RNA跑个电泳，看看RNA是否降解了。当然，如果目的基因丰度高的话，即使RNA部分降解反转录之后也能扩出目的基因。另外，反转录之后，可以先用1微升cDNA作为模板，扩增看家基因（比如β－actin），如果扩出的特异性条带很亮，说明你的RNA没什么太大问题。
不过，我感觉基因好不好扩跟目的基因在组织中的丰度有很大关系，如果丰度低，那么对RNA的要求就高。
请有经验的人帮你分析分析引物有无问题，primer5.0就很好用。可以试试梯度PCR，如果没有条件的话，也可以
顶部
小鱼鱼[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73389
精华 0
积分 276
帖子 331
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
5

发表于 2011-9-22 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，你的RNA提取过关吗？建议提完RNA跑个电泳，看看RNA是否降解了。当然，如果目的基因丰度高的话，即使RNA部分降解反转录之后也能扩出目的基因。另外，反转录之后，可以先用1微升cDNA作为模板，扩增看家基因（比如β－actin），如果扩出的特异性条带很亮，说明你的RNA没什么太大问题。
不过，我感觉基因好不好扩跟目的基因在组织中的丰度有很大关系，如果丰度低，那么对RNA的要求就高。
请有经验的人帮你分析分析引物有无问题，primer5.0就很好用。可以试试梯度PCR，如果没有条件的话，也可以使用降落PCR，并结合热启动，我的几个基因都是这样扩出来得。
总之，你的确应该从头做起。不要着急。我也是新手，不知说的对否，欢迎大家一起讨论。
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
6

发表于 2011-9-22 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做RT_PCR有一段时间了，但是我怎么调Tm直，改变引物（已经设计了两对引物了）可是总有引物二聚体，我要的目的条带都没有，郁闷死了！！请大家帮我分析一下，是不是我得cDNA有问题，我在翻转之前没有测OD,只是跑了一下一般的琼脂糖电泳。有什么好的方法吗？

==============================================================================================================

RT-PCR的关键在以下几点：
1、引物设计合理否，如果有非特异条带出现而不见目的条带，改变条件也不见改变，则可能是引
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
7

发表于 2011-9-22 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做RT_PCR有一段时间了，但是我怎么调Tm直，改变引物（已经设计了两对引物了）可是总有引物二聚体，我要的目的条带都没有，郁闷死了！！请大家帮我分析一下，是不是我得cDNA有问题，我在翻转之前没有测OD,只是跑了一下一般的琼脂糖电泳。有什么好的方法吗？

==============================================================================================================

RT-PCR的关键在以下几点：
1、引物设计合理否，如果有非特异条带出现而不见目的条带，改变条件也不见改变，则可能是引物设计时出现问题，引物设计要BLAST一下，引物二聚体感觉完全没有似乎不大现实，只是强度的问题，如果太强建议减少引物的浓度
2、RNA的提取，也很重要，我感觉OD在1.6-2.0，浓度不要太低就可以做RT了，如果超过2.1，说明降解较严重，最好放弃，重提
3、就是目的基因本身的丰度，如果含量较低则对cDNA的要求较高，反之则较低，不知你内参作的情况如何，一般说如果连内参都没出来，肯定cDNA问题大了
以上是我几个月做RT的心得
希望你能把你的具体条件说说，我们共同探讨一下
顶部
panda王[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72140
精华 0
积分 852
帖子 1444
信誉分 100
可用分 7919
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
8

发表于 2011-9-22 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我不知道内参是怎么做的，bbs上大家建议我做b-action,但具体步骤不太清楚，请指教.
顶部
冰激凌小姐[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70423
精华 0
积分 216
帖子 212
信誉分 100
可用分 1761
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
9

发表于 2011-9-22 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我不知道内参是怎么做的，bbs上大家建议我做b-action,但具体步骤不太清楚，请指教.

===============================================================================================================

应该是beta-actin吧。和一般的PCR一样的做法，在你要扩增的动物基因组的beta-actin上设计引物，反应体系中多加上beta-actin的一对引物就可以了呀，其它的条件不用变，当然beta-actin的引物退火温度和你的目的片断退火温度应该不是相差太大。
顶部
panda王[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72140
精华 0
积分 852
帖子 1444
信誉分 100
可用分 7919
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
10

发表于 2011-9-22 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我得材料是植物的，那用什么内参好呢？  
顶部
 18  1/2 12››