为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度

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标题:为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度

ffooll[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度 [转载]

理论上应该扩增出超过2kb的片段，但每次得到的PCR产物都只有700多bp，跟这个基因的cDNA长度类似。换过好几个模板，得到的结果都相同。
上游引物：CATGAGCTACATCAATCTGCCC
下游引物：AGTCCAACCTGGGTAGGAG
Genebank上查到的序列：小鼠胸苷激酶（tk）基因M68489
1 ccatggcaga tccggaggga tggtcgagct ccaggctttt cacgtagctg agaggtggga
61 cgagtcttgt cttcgtcccg cccccttttg agttcgcggg caaatgcgag cagtaagtcg
121 aaatttttcc acccacggac tctcggtgct aactaaggtt tgcacagcag ccatgagcta
181 catcaatctg cccaccgtgc tgcccagctc ccccagcaag actcgggggc agattcaggt
241 gcggggtctg gagtggggtc gggtggtggc tggtgcgggg tgtacaaggg ggagacccct
301 taaatgactt ctcttctagg tgattctcgg gcccatgttc tcagggaaaa ggtaatgaat
361 gggccttcgg ggcggtgggc ctccctctct ctctgcagcc tctctctctg caggccctgg
421 ctctcctctc ccccctcccc catcttccag gagcctctga ctaggcggca aacgcgctcg
481 acctctgtgt gtacattccc gcccaaaatt cgatttcctg gattgctgcc atcctcctgc
541 ccaagccttt tctcttgggg aaccctatct ttgctgaggc ggaccacatg ggggtacaat
601 tgaagacccc agcccacatt acccaggagc cccaccgaac tctcatgtgt ccctgggagt
661 taggcacctt ctctgacagt ttcctcattc attccccatg cgagctccta agctggagcc
721 aattaactct gaggtgaggt ctaaactctg gagtcccacc cagaataaca ggctaccgac
781 gctaggtggt agtggcagcc cgccttttgc tcgggcctca tgtgctctgg ttaattcttg
841 cagcacagag ctgatgagaa gagtccggcg cttccagatc gcccagtaca agtgcctggt
901 catcaagtat gccaaagaca cgcgctatag caacagcttc tccacacatg atcggtcagt
961 cctacccctg agcctgccct tcggaaaccc ctaagcctcg ggggcacact gactgctagc
1021 ctctagtgga tatgaataag tgctcaaaac tactagatac tgtccagtgt catgtaccac
1081 gagctggaga ctgtcactgt agagctgcag attaggtgac actatagaat actcaagctt
1141 ggtctctgcc cttgctcatt cttggccttc tcttcccagg aacaccatgg acgcattgcc
1201 agcctgcatg ctccgcgatg tgacccagga ggccttgggt gtggccgtca ttggcatcga
1261 tgaggggcag tttgtaagtc agcctgcagc ataacctcac cctgacccct gacccttcct
1321 gccctgctga ctcagaagtc cctgtcatta acttgtcttt actggggtgc ggatccaatt
1381 cgccctatag ctgagtcgat acaatcactg gcgtcgtttg catgctcagc tcccccacgg
1441 tcttcgtcag gcccttgcct ggggcagata acctcatcct ctggactttt cccagtttcc
1501 tgacattgtg gatttctgtg aaatgatggc caacgagggc aagacagtaa ttgtggcagc
1561 gctggatggg accttccaga ggaaggtaag atgtctgact ctggcttggc acagtgcaga
1621 ggcacagctc ctgacgttgc tctctggccc ccacacacat acacatgtga acacaggcag
1681 aggagggagg tgcctggcta actgaccgca cacacctgct gctgtcttcc gtgcaggctt
1741 tcggcagcat cttgaacctg gtgcccctgg cggagagtgt ggtgaagctc accgctgtgt
1801 gcatggagtg cttccgagaa gctgcctaca cgaagaggct gggcctggag aaagaggtac

ffooll[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1861 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacaaca
1921 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacttact tctgcccaag gagtggggtg
1981 ggcttaggct ctggcttctg agtcccaccc tcacatctcc ctcccaccag ggtgaggtga
2041 ttgggcctgg agaaagaggt atacacacac acacacacac acacacacac ttctgcccaa
2101 ggagtggggt gggcttaggc tccggcttct gagtcccgcc ctcacatctc cctcccacca
2161 ggtggaggtg attggcggag ccgacaagta tcactccgtg tgccgcctgt gctactttaa
2221 gaagtcttca gcccagactg ctggctcaga caacaagaac tgtctggtgc tggggcagcc
2281 gggagaggcc ttggttgtca ggaagctctt tgcctctcag caagtcctac aatacaactc
2341 tgccaactga ggggacctga ggcctgccag ctcctaccca ggttggactc tcagagagca
2401 gggggagcgc gggcctgcca ttcctaatgg acaatgtacc ttgaacaggc tgccactcgc
2461 tgaagccgtt ttcagttccc ttcttgattg ccaagatgcc tcaatgcaga ctggagccca
2521 gaccctgcct ggtggctagc ggtcccgtgt tcagccaaag gtgaggacag agctgtccag
2581 cattgtgaca ctggtggggc tagtttcttc cttgttcgtg gctgggtttc agtctcagag
2641 ccccaccctc accaaggctc cacgcctctc acagctcccc catttatgcc taaacattct
2701 ctcctcagaa cctcagctct tagtgagcca cttttcttgt gcaaaatgaa caatattaaa
2761 gtttactact aatgagaacg tgtttctcct tagcctgggt ttccctaact tgcaaccggc
2821 acccacatga cttgggggta gaaatgtgtt ttgtagtacc aatggtctca ccacagccca
2881 agaagaacag tcccccacat ttctatctgg ttggtttcgt gacaaaaaat ggcaaagaa
PCR条件：94℃7min，（94℃1min，58℃30s，72℃4min）×30，72℃10min。
后来换了一对引物。
上游引物：5' AgC AgC CAT gAg CTA CAT CAA TC 3'
下游引物：5' gAg Tgg CAg CCT gTT CAA ggT AC 5'
再用同样的条件扩增就完全没有产物了。
各位帮帮忙啊，看看到底哪里有问题。
谢了先。

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发表于 2011-9-22 16:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第二对引物的下游引物写错了，应该是5' gAg Tgg CAg CCT gTT CAA ggT AC 3'。

mooon[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

也许有同源序列，或者污染1
提高温度！94度只要30秒够了！退火温度提高到62度

caihong[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，建议将退火时间改为1分钟，退火温度可在60度左右调整。
其次，你所用的体系可能不适合你要扩增的片段，建议使用长片段扩增体系。

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发表于 2011-9-22 16:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

变性时间缩短到30秒了，退火温度在60度、62度，时间延长到1分钟，都没有产物。

guagua[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

重新合成一条或者两条中间引物，与你现在使用的引物分别成为一对引物，预期PCR产物为1-1.5kb，看能不能扩增出来。

如果至少有一端能扩出来，那问题就好办一些。你觉得呢？

Darcy[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最大的问题在于：

你的序列中的碱基组成很不均匀（具体见附图分析），连续的G或C很多见，所以虽然平均的GC含量为55%左右，但局部的GC含量有的甚至高达80%,所以常规的PCR很难奏效。

建议使用高GC扩增条件。比如可以使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增。

[ 本帖最后由 Darcy 于 2011-9-22 16:46 编辑 ]

附件

2011-9-22 16:46

36238811.png (36.4 KB)

Darcy[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

此外，很不明白的是：为啥你要扩基因组序列，而不直接扩增CDNA。

果冻也酸[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问你上面分析产物GC比的软件是什么呀？
谢谢！

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