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标题:请教,超过溴酚兰的亮带是什么?

知了知了[使用道具]
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发表于 2011-9-22 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教,超过溴酚兰的亮带是什么?

请教,超过溴酚兰的亮带是什么? [转载]


近日,做PCR扩增,电泳后发现除了目的条带外,在溴酚蓝前面(超过溴酚蓝)还有一条带,且非常亮,多次重复均如此,特别是,每次的阴性对照(加水替代模板DNA)也有溴酚蓝前面(超过溴酚蓝)的亮带,但无扩增目的条带.请各位指点,溴酚蓝前面(超过溴酚蓝)的带是什么?
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大仙[使用道具]
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发表于 2011-9-22 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
会不会是二聚体？
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发表于 2011-9-22 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很可能是引物的dimer

1，因为在你的阴性对照中也出现了这样的情况，其中唯一的核酸就是primer。用引物设计软件，如GENETOOL，检查一下引物形成dimer的可能性的情况。

2，溴酚蓝代表一定分子量的片段，根据不同的浓度的胶有不同的情况。如你的胶是8%的PAG，那么其代表45bp左右的片段。而可能你的引物的dimer是小于这个片段长度的，所以也支持是primer dimer的假设。

3，减少引物dimer的方法很多，本版面可以搜索一下，然后改进体系吧，或者换引物。  
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知了知了[使用道具]
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发表于 2011-9-22 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢两位
可是,如果是primer dimer,为什么预计的片段也出来了?难道primer dimer只是部分影响反应吗?这种情况下得到的目的片段是否其正确性也令人怀疑?
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发表于 2011-9-22 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢两位
可是,如果是primer dimer,为什么预计的片段也出来了?难道primer dimer只是部分影响反应吗?这种情况下得到的目的片段是否其正确性也令人怀疑?

================================================================================================================

有primer dimer，并不是说在这个体系下全部的primer都自身成dimer了，还有部分和模板DNA结合参与PCR扩增，通过调整体系，可以尽量的减少形成dimer的primer的比例。

目的片断的正确性我觉得问题不大，你可以核对一下出现的片断的位置和你欲扩增的位置是否吻合。实在放不下心，拿一个样，花60元一个反应就测序完成了
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发表于 2011-9-22 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
超过溴酚蓝的一般来说是二聚体
产生的主要原因是引物的浓度相对偏高
你可通过增加模板量及减少引物的量来实现
看看这个帖子,对你会有帮助的,祝你成功!
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=616360&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#616360')
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发表于 2011-9-22 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的话有道理，我也曾出现这个问题，减少引物用量，提高退火温度1－2度，臭酚兰前面的带会减弱。
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-22 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
超过溴酚蓝的一般分子量＜３００ＫＢ，以引物二具体的可能性最大．但是我觉的如果特异性的条带如果扩出来，引物二聚体的亮度就要淡的很多．
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如影随形[使用道具]
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发表于 2011-9-22 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到过类似问题，大家都这样说，是二聚体的可能比较大，但真的很亮，并且独立成带，与二聚体那种淡淡的感觉很不一样。减少引物的量和增加退火温度后就只有这条带了并更亮，主带反而没有了。最后没有办法，重新合成引物，序列没有换，就这样作了，对结果影响也不大。
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发表于 2011-9-22 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能是RNA的降解产物，你把cDNA跑电泳试试看，如果在溴酚蓝前面有这种条带，那就肯定是RNA降解的产物，你只要减少RNA用量，并且注意在逆转录时将处理过的RNA置于冰上，就可消除此条带。我也曾经遇到此问题。  
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