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标题:引物使用过程中遇到的奇怪问题

圆圆圈圈[使用道具]
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引物使用过程中遇到的奇怪问题

引物使用过程中遇到的奇怪问题[转载]


各位战友好!
PCR 引物很是奇怪:引物干粉溶解了,刚开始使用时,可以扩出特异条带,达到所需目的。然后逐渐就不行了,越来越差,直至扩的是SMEAR。怀疑引物降解了,就放下不用它,另合成新的。可原引物放置一段(4度下)时间后,却再次能使用了!!与人交流时才知道,这种问题还不是我一个人遇到。同仁做突变体库,使用大量特异和简并随机引物,对同样的某些引物而言,一段时间内用得很好,一段时间却尽扩出SMEAR,这段时间,他们痛苦得不得了!
到底是什么原因?引物合成的问题吗??为什么引物象病人样,时好时坏?
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椰子叶子[使用道具]
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各位战友好!
PCR 引物很是奇怪:引物干粉溶解了,刚开始使用时,可以扩出特异条带,达到所需目的。然后逐渐就不行了,越来越差,直至扩的是SMEAR。怀疑引物降解了,就放下不用它,另合成新的。可原引物放置一段(4度下)时间后,却再次能使用了!!与人交流时才知道,这种问题还不是我一个人遇到。同仁做突变体库,使用大量特异和简并随机引物,对同样的某些引物而言,一段时间内用得很好,一段时间却尽扩出SMEAR,这段时间,他们痛苦得不得了!
到底是什么原因?引物合成的问题吗??为什么引物象病人样,时好时坏?

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PCR出现重复性不好,怎么能都怪引物呢,引物合成一般是不会有问题的,也可能会有问题,但是可能性确实太小了,重复性怎么样主要是看你的退火温度的选择,体系的组成,模板的质和量,而不是引物。
引物干粉,在4度可以放很长时间,半年以上不会有问题,如果是已经融了的引物4度两个月不会有问题。
寻找PCR出现这些问题的原因放到其他方面吧,最主要的是体系和退火温度。不要放到引物上。
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过路甲[使用道具]
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请教一下:什么是SMEAR?
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弥散,就是出现拖尾!
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ffaa[使用道具]
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弥散,就是出现拖尾!
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庄梦蝶[使用道具]
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位战友好!
PCR 引物很是奇怪:引物干粉溶解了,刚开始使用时,可以扩出特异条带,达到所需目的。然后逐渐就不行了,越来越差,直至扩的是SMEAR。怀疑引物降解了,就放下不用它,另合成新的。可原引物放置一段(4度下)时间后,却再次能使用了!!与人交流时才知道,这种问题还不是我一个人遇到。同仁做突变体库,使用大量特异和简并随机引物,对同样的某些引物而言,一段时间内用得很好,一段时间却尽扩出SMEAR,这段时间,他们痛苦得不得了!
到底是什么原因?引物合成的问题吗??为什么引物象病人样,时好时坏?

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还有一个办法就是将引物分装成许多小管每次用一管减少污染可能。
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冰激凌小姐[使用道具]
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为什么要4度,为什么不是零下20度  
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引物的最好使用方法是公司合成以后,自己溶解好,然后分装再冻干保存。这样能够保存你的引物至最长的时间。

通常,我们没有冻干设备或是嫌弃这样太麻烦,我们把引物的母液分装保存在-20度下,用的时候溶解稀释。平常使用的就放在4度。一般是没有什么问题的。

如果同一管引物以前是良好工作的现在出了问题,一般应该是检查反应体系、反应条件、药品是否污染等。
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@花开花落@[使用道具]
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其实引物的保存大家都知道,分装,-20度保存,我的经验问题可能不是出在引物上,我在做的过程中也遇到过这样的问题,各种条件都查了,最后发现,问题出在cDNA上,大家都认为DNA是很稳定不会降解的,其实,我曾经检验过,cDNA 在-20度一个月以后会逐渐降解!
是否对搂主有启发!
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圆圆圈圈[使用道具]
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cDNA 在-20度一个月以后会逐渐降解吗?这个,我倒是不太清楚,因为我没有做过CDNA,但我知道DNA的稳定性是相对的,相对于RNA而言,它是较稳定的,但绝不等于难以降解。在-20度可以保存很长时间,甚至是几年;但在4度的保存时间是有限的,我的经验是,不应该超过3个月,而且是要用BUFFER溶解的。用水稀释后更易降解。不知道CDNA为什么保存时间这么短?
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