SYBR Green PCR

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标题:SYBR Green PCR

楚留臭[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SYBR Green PCR [转载]

前段时间订购回了SYBR Green 试剂，再进行实验发现阴性对照有扩增，
于是换了反应管，tip,灭菌水，重新稀释引物，但结果依然。我把体系
列再下面，请大家帮我分析以下原因。我本打算重新设计引物了。

1.conventional-PCR:
反应体系：ddH2O 12.2微升
10*Buffer 2.5微升
2.5mMdNTP 2微升
25mM Mg+ 4微升
10微mol Primer各1.8微升
Taq酶 0.2微升
模板 0.5微升
total:25微升
反应条件：95度5分钟，
95度 20秒，55度 20秒，72度 30秒，40个循环

2.SYBR Green PCR:
反应体系：Master Mix:12.5微升
RNase-Free H2O:7.9微升
模板：0.5微升
10微mol Primer各1.8微升
UNG:0.5微升
total:25微升
反应条件：50度2分钟，95度15分钟，
95度20秒，55度20秒，72度30秒，40个循环

扩增子均为63bp,Mg+4mM,引物0.6pmol,模板（原液180ng/微升）

楚留臭[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

由于此次购置之前，一直结果很稳定，但试剂是promega的，也应没问题才对吧？

喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这样看来还是污染的可能性大，把整个体系全换新的，再试试看。注意不要有环境的污染。

楚留臭[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢主任！
我在的实验室主要不是做科研的实验室，经常会检测一些转基因产品或抗生素残留以及动物组织成分检测，都是用试剂盒检测。
那我在更换体系后要注意防止污染了！有点头痛！

+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看来你要做好换引物的准备了。
先试一试将体系的Mg++,或引物浓度降低。扩增圈数减少。
若不行，换引物。
注意：新引物一定要避免形成引物二聚体。

楚留臭[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢各位了，
上次设计引物用的是primer express,按其中的taqman探针引物一栏设计的（没有单独的SYBR Green PCR引物设计一栏），选择了得分最高的一对引物后先进行了conventional PCR 调整了Mg++，和引物浓度，以及循环次数从35--40，（其依据是条带的明亮度最亮和二聚体带最不明显），
再以此条件进行SYBR Green PCR,前一个试剂是ABI的，酶，UNG,Mg++,dNTP都是分装的，后来酶没了，没有购来合适的，就改定了Qiagen的试剂盒，上面提到扩增子最好大于150。其中的Master Mix合成了以上几项，但未含有UNG，为防污染，我将前一试剂盒的UNG利用上，做了未用UNG的对照，结果阴性对照扩增仍同阳性。
我想用Oligo设计一对引物，扩增子在100以上。
谢谢lizt的建议，我马上去试一下，

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用熔解曲线可以区分非特异性扩增，ABI的仪器如5700、7000等都有这个功能，不知道你用过没有。用SYBR做实验，好像阴性对照有增长，因为SYBR是非特异的，如果你看一下它的解链曲线的话，就会发现阴性对照的曲线的高峰的温度在80度以下。如果是阳性的话，它的解链温度应该至少在80度以上。
运行仪器前点击Disosiation即可。

楚留臭[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是7700的机型，到ABI的网页上下载了一个dissociation curve 的软件，
primer1的Tm是58，primer2的Tm是59，Amplicon的Tm是84，
阴性对照的溶解只有一个峰值78.8左右。阳性的峰值也差不多(Qiagen)
以前用ABI的试剂，同样的引物和反应条件，阴性对照的峰值76，阳性80。
我想弄一张图片上来，可是Mac上的图片，不知如何转化到windows,我再试！

冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

l楼上的SYBR® Green I是在那里买的，我也想买一个，价钱如何？

楚留臭[使用道具]
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发表于 2011-9-23 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

ABI 仪器买时自带了一个SYBR Green PCR Core Reagents 试剂盒
后来买的是在基因公司购买的：
货名：Quanti Test SYBR Green PCR Kit 规格：200rxns 货号： 204143
产地：Qiagen 价格：5822RMB

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