PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 引物设计的疑惑

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 18  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:引物设计的疑惑

冰儿0109[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73475
精华 0
积分 201
帖子 142
信誉分 100
可用分 1461
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
1

发表于 2011-9-23 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物设计的疑惑

引物设计的疑惑[转载]


我最近用PRIMER5.0验证SCIENCE的一篇文献中的引物(12条,20缄基/条),发现每条引物只有5个硷基和MRNA互补,不知什么缘故,想听听大家的看法.
顶部
不懂[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70203
精华 0
积分 208
帖子 195
信誉分 100
可用分 1661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-6
状态 离线
2

发表于 2011-9-23 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你确定在primer5.0所用的序列和文献中所引用的是一致的吗？
顶部
boom[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73296
精华 2
积分 312
帖子 216
信誉分 104
可用分 1931
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-21
状态 离线
3

发表于 2011-9-23 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近用PRIMER5.0验证SCIENCE的一篇文献中的引物(12条,20缄基/条),发现每条引物只有5个硷基和MRNA互补,不知什么缘故,想听听大家的看法.

=================================================================

建议您先确定所用的序列是否正确，一般情况下不会出现这种情况的

可以从序列号，对应的amino acid等序列情况对比一下，看看是不是就是文献中的序列

如果还是不行的话，请您把文献公布一下，大家集思广益看个究竟。
顶部
小困[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70008
精华 0
积分 177
帖子 94
信誉分 100
可用分 1207
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
4

发表于 2011-9-23 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果这些引物加了两个酶切位点和三个保护碱基的话正好20个，呵呵，你看看引物里有没有酶切位点吧
顶部
冰儿0109[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73475
精华 0
积分 201
帖子 142
信誉分 100
可用分 1461
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
5

发表于 2011-9-23 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
mouse  Forward primer   reverse primer
insulin I  TAGTG ACCAG CTATA ATCAG AG   5ACGCC AAGGT CTGAA GGTCC
insulin II  CCCTG CTGGC CCTGC TCTT   5AGGTC TGAAG GTCAC CTGCT
glucagon  TCATG ACGTT TGGCA AGTT   5CAGAG GAGAA CCCCA GATCA
IAPP  GATTC CCTAT TTGGA TCCCC   5CTCTC TGTGG CACTG AACCA
Glut2  CCACC CAGTT TACAA GCTC   5TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC
PDX-1  TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC 5 CCACC CCAGT TTACA AGCTC
acarboxypeptidase A  GCAAA TGTGT GTTTG ATGCC   5 ATGAC CAAAC TCTTG GACCG
OCT-4  GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC   5 CTCGAACCACATCCTTCTCT
GATA-4  CGCCGCCTGTCCGCTTCC  5 TTGGGCTTCCGTTTTCTGGTTTGA
HNF3b  ACCTGAGTCCGAGTCTGACC  5 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC
请各位看看有没有酶切位点
另外，我查到的MRNA序列(mouse)如下：
insulin 1 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31982248')
INSULIN2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31982250')
glucagon cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=34328120')
IAPP cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6754271')
GLUT2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=00414678&dopt=GenBank')
PDX-1 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31560657')
OCT-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31980770')
GATA-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6679952')
HNF3b cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=22074389')
ACTIN BETA cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6671508')


查看积分策略说明
附件
2011-9-23 11:09
66596074.jpg (42.58 KB)
 
顶部
韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
6

发表于 2011-9-23 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
mouse  Forward primer   reverse primer
insulin I  TAGTG ACCAG CTATA ATCAG AG   5ACGCC AAGGT CTGAA GGTCC
insulin II  CCCTG CTGGC CCTGC TCTT   5AGGTC TGAAG GTCAC CTGCT
glucagon  TCATG ACGTT TGGCA AGTT   5CAGAG GAGAA CCCCA GATCA
IAPP  GATTC CCTAT TTGGA TCCCC   5CTCTC TGTGG CACTG AACCA
Glut2  CCACC CAGTT TACAA GCTC   5TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC
PDX-1  TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC 5 CCACC CCAGT TTACA AGCTC
acarboxypeptidase A  GCAAA TGTGT GTTTG ATGCC   5 ATGAC CAAAC TCTTG GACCG
OCT-4  GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC   5 CTCGAACCACATCCTTCTCT
GATA-4  CGCCGCCTGTCCGCTTCC  5 TTGGGCTTCCGTTTTCTGGTTTGA
HNF3b  ACCTGAGTCCGAGTCTGACC  5 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC
请各位看看有没有酶切位点
另外，我查到的MRNA序列(mouse)如下：
insulin 1 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31982248')
glucagon cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=34328120')
IAPP cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6754271')
GLUT2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=19465565')
PDX-1没查到
OCT-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31980770')
GATA-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6679952')
HNF3b cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=22074389')

-=============================================================================================================

我给你查的，以insulin I为例：

ggggggntttagtgaccagctataatcagagaccatcagcaagcaggtcattgtttcaacatggccctgttggtgcacttcctacccctgctggccctgcttgccctttgggagcccaaacccacccaggcttttgtcaaacagcatctttgtggtccccacctggtaaaggctctttacctggtgtgtggggagcgtggctttttttacacacccaagtcccgccgtgaagtggaggacccacaagtggaacaactggagctgggaggaagccccggggaccttcagaccttggcgttggaggtggcccggcagaagcgtggcattgtggatcagtgctgcaccagcatttgctccctctaccagctggagaactactgcaactaaggcccacctcgacccgccccacccctttgcaatgaataaaacttttgaataagcaccaaaaaaaagagttttataatgaatg

你自己用文献里的引物比一下，是不是正确的

好了，自己再看看是不是
顶部
冰儿0109[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73475
精华 0
积分 201
帖子 142
信誉分 100
可用分 1461
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
7

发表于 2011-9-23 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
虽然我查的和你查的连接地址不同，但都是GI:31982248
顶部
冰儿0109[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73475
精华 0
积分 201
帖子 142
信誉分 100
可用分 1461
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
8

发表于 2011-9-23 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
虽然我查的和你查的连接地址不同，但都是GI:31982248
顶部
#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
9

发表于 2011-9-23 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酶切位点有，你可以通过premier分析它的酶切位点，我看了前两个，酶切位点都是很少见的酶，估计不是设计上的。
顶部
+田田+[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71224
精华 0
积分 216
帖子 192
信誉分 100
可用分 1691
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
10

发表于 2011-9-23 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
虽然我查的和你查的连接地址不同，但都是GI:31982248

===========================================================

你不是觉得，文献里的primer不是完全和mRNA里的序列能对应上么？

我找了一个insulin I，但是我验证后，primer和mRNA的序列是完全对应上的啊

不知道你为什么提到只有5个base能对上
顶部
 18  1/2 12››