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标题:la Taq也没P出来,急！

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发表于 2011-9-23 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

la Taq也没P出来,急！

la Taq也没P出来,急！[转载]


我做大鼠心肌的醛固酮合酶RT－PCR，都2个月了，一点结果都没有，偶尔出一条带还不是我所需要的条带，最近有人看了我的基因序列发现局部GC 含量高，建议用la Taq,就又花了300多元反复作了多次还是没有结果，用脑及肾上腺的cDNA作阳性对照也同样，而用同样的cDNA能扩出其他4对目的基因。真郁闷啊，快过年了，老板说节前做不出来节后先上班，业余时间作试验，一定要做出来。看来春节过不好了！那位高手能指点迷津,在下多谢了。
我的条件是94度2min预变性，94度30se,58-68度30－40se（都试过1次）,72度1min,35－40循环，用的Takara的lat aq,2xGC buffer
up 5' ACCATGGATGTCCAGCAA 3'
down: 5’ gagagctgccgagtctga 3'
CYP11b:
gccgcttttttttttttttttttttaggtaaatagtaaagcctttattttcttgttaaga
acagcattttgaaaataaaacctatctgcccatgcttaacaacctttaaagtctgtgata
ttttatatacagccctgtacatactgattgtctggaaatttcttaaacagtttttgttta
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发表于 2011-9-23 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
attgtcatcattcaacacaactgtacacagtttacagctgaagacctccagcatcaggta
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上游引物位置861-879bp,下游1141-1159bp,产物长度 298bp
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发表于 2011-9-23 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
镁离子浓度呢?
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发表于 2011-9-23 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的引物质量不是太好,你不是还有其他几对引物吗,看是否有F/R外部的合适引物,可以考虑做个套式PCR.
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发表于 2011-9-23 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的引物质量不是太好,你不是还有其他几对引物吗,看是否有F/R外部的合适引物,可以考虑做个套式PCR.
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 小中大
la Taq 有,5mg/1.25ml
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 小中大
你的退火温度太高了，用最简单的Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)，你的两引物为54和58，建议你从50度或更低至45度开始P。
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发表于 2011-9-23 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这么短还需要LA taq?普通taq,用2对引物，做巢式pcr一定能出来。  
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麻瓜[使用道具]
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 小中大
问一句啊，什么是LA TAQ？

请指教啊
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微笑的海豚[使用道具]
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 小中大
LA TAQ是宝生物生产的专门扩增长片段或高GC含量片段的 TAQ酶.比较贵.  
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