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标题:半定量Rt-Pcr的误差有这么大么？？

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发表于 2011-9-23 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

半定量Rt-Pcr的误差有这么大么？？

半定量Rt-Pcr的误差有这么大么？？ [转载]


我在做半定量Rt-Pcr 如下图。跑出来发现平行样的亮度差异颇大。
实验设计：
共有4个cDNA的样本,分别命名为A,B,C,D，检测其中某基因表达的差异。
为了准确每个样本设3个平行样，也就是说 A1, A2 ,A3 均是从同一管(A管)取等量的（3UL）cDNA，加入同样的反应系统（先配好反应系统再分装到各pcr管中），用同一次pcr反应跑出来的。
发现平行样的亮度差异颇大。尤其是A 和C系列，几乎相差两倍。
请问各位大侠，PCR中平行样的误差真有这么大吗？？还是我的操作有问题？？
请各位大侠帮忙………………….
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我用的是50ul的反映系统，条件是：94 ℃ 30秒 ，55 ℃ 60秒， 72 ℃60秒。
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2011-9-23 11:48
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 小中大
1, more practice, mix every reagent well, accurate and constant aliquote.
2, go to Roche web site, for lightcylcer discussion forum to see what to do
3, check literature. I don't have semi-quantitiative pcr experience.
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 小中大
你应该先建立梯度线形关系。
半定量PCR方法只要有一点误差就会被放大，所以是个不准的定量方法。现在已经不太用了。
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 小中大
梯度线形关系我已经建立，还不错。
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 小中大
请问什么是梯度线性关系？谢谢
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 小中大
请问什么是梯度线性关系？谢谢
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 小中大
就是把对半稀释的cDNA拿来一起扩增，看看扩出来的条带的亮度跟cDNA浓度是否成比例。如不成比例则需要改pcr参数，因为这说明扩增到了平台期或什么其他原因，总之是不能用来半定量的啦。
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 小中大
再请问，每个样本都应该这样吗？  
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 小中大
再请问，每个样本都应该这样吗？  
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 小中大
不必每个样本做。只要证明pcr扩增产物的浓度与模板浓度成比例就行了。当然各个样本模板的浓度不能差异太大。
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