求助：如何回收电泳条带？

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标题:求助：如何回收电泳条带？

lixi559[使用道具]
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发表于 2011-9-23 15:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助：如何回收电泳条带？ [转载]

我想从普通琼脂糖凝胶中回收PCR产物进行测序，应该怎样进行？在送公司测序前需要进行哪些处理？

冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-9-23 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我不知道你的琼脂糖质量如何，测序要求样品纯度要高。最好有浓度测定。

样品要分离干净，不要和其他条代混合。有时候PCR产物看是一条其实是两条。我建议你现联入载体再测序。

这样省钱和时间。

测序可以直接寄菌给他们，让他们自己提取质粒测序。

冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-9-23 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

loli[使用道具]
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发表于 2011-9-23 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意楼上，如果你的条带很多，可以先回收目的条带，你可以用回收试剂盒，生工，博亚等都有，我用生工还可以，将该条带回收后，加A后连接到T载体平板蓝白筛选后再测序，这样最稳妥，可能麻烦点，但的确应该这么做。千万别想省事反而费时费事，呵呵。

lixi559[使用道具]
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发表于 2011-9-23 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢两位。我的目的条带只有一条也需要这样做吗？是否必须回收条带后进行载体联接，然后筛选再测序？

大猫[使用道具]
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发表于 2011-9-23 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR之后,切下你的目的基因,可以用凝胶回收试剂盒回收,我用的是TAKARA Fragment Recovery kit (D301)按照说明即可.然后，用pMD18-T VECTOR(TA-专用载体）。

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-23 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢两位。我的目的条带只有一条也需要这样做吗？是否必须回收条带后进行载体联接，然后筛选再测序？

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你的目的条带只有一条根本不用切胶回收，测序公司也不会推荐你这么做！你只需把电泳检测了的样品给测序单位，他们负责纯化。
以目前的测序水平，PCR产物测序已经非常简单了！技术成熟（专门对PCR产物的BigDye 1.1），结果好。

PCR产物送测要求：浓度不能太低；万一PCR产量低，就增加送样量。
提供的测序模板的长度信息。
自带的测序引物浓度在3.2 pmol/ul。

PCR产物测序的弊端是，引物序列引物后30bp读不清楚。如果这个区域对你来说很重要，就双向测序的说！

lixi559[使用道具]
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发表于 2011-9-23 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢楼上，还有一个问题，什么叫自带的测序引物？是PCR扩增时的引物还是另有所指？另外，一般在什么情况下要进行切胶回收，然后联接载体筛选后测序？

=菓子=[使用道具]
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发表于 2011-9-23 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自带的测序引物当然是你PCR扩增时用的引物。
进行PCR产物测序必需提供相应的两端引物，并提供引物的全序列，且引物要保证一定的浓度。
但PCR产物有双带或产物条带弥散的样品一般建议克隆后再进行测序。

flower@@[使用道具]
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发表于 2011-9-23 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看看这个吧，是我知道的最便宜的回收条带方法。

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=674374&sty=3')

应该把PCR产物克隆到载体上再测序，否则5’或3’起始的一段序列可能测不出来。

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