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标题:请问EB是不是多多益善啊

喜乐lele[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问EB是不是多多益善啊

请问EB是不是多多益善啊


各位大虾：
有礼了。
跑PCR的电泳，一直用 的是师姐给的配好的EB,她告诉我说10ml的胶中加1ul 的EB。可是根据这几天的结果似乎用6ul有时都不够，今天一下狠心加到10ul，条带就很亮，但是跑过一半近30分钟后条带还是会变淡。
我想问问，EB的量有没有限度呢，是不是越多越好呢？
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春雨[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
适当就可以了

强致癌性的东西，用量要限制，否则对身体没好处
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
凝胶的配制：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。

溴化乙锭(ethidium bromide，EB ) ,是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.

一般EB的终浓度是0.5ug/ml， 常将EB配制成10mg/ml再贮存的，10ml的胶中加1ul 的EB应该可以了。适当可以增加用量，但量多会因为染色太深而条带不清。再说正如楼上说的，有毒艾，还是小心为妙。
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雪花子[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
EB量太多会导致背景变黄，不信可试试。跑一半颜色变淡是因为电泳时EB向相反方向跑，可以在电泳液中加入EB解决，但安全起见还是不加为好，只要跑电泳时多看就是了。
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发表于 2011-9-24 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
EB和你的电泳产物泳动的方向相反,EB浓度太高,在紫外灯下观测条带会发现凝胶的上半部分很亮背景很高,这是因为EB的反方向泳动在上半部分产生堆积浓度比你加的时候更高,当然会影响你观察条带的效果.如果你觉得在凝胶中加EB效果不好,你也可以先电泳,再把凝胶浸入nancyscm所说的EB溶液中,这样会比较均匀.最重要的当然是注意安全,在热的琼脂糖中加EB会有挥发的,加多了当然更是不秒,生物安全意识也很重要!
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蝴蝶结子[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
EB加的过多后还有一个明显的缺点：背景很亮，暴光稍强，就会呈现一片白；而暴光不足条带又不清晰。
其实，EB确实不需要加得多。我们实验室习惯于用吸了EB的尖头吸管稍稍靠一下瓶臂，流出一点就足够了。再次重复使用的AGROSE GEL，根本不需要再补加EB。所谓的“EB见光分解“的说法，并不适用于此。
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mod=8048[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
据我看的一本生物实验的PROTOCOL的书上讲,

100 ml 里只放 1 ul 我不太清楚ACTIVATION 说的 尖头吸管是什么东西,

流出一点大概是多少? 有点笼统了, 象中国做菜, "放盐少许"  
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
适量就行了，俺有一阵子做电泳，嫌麻烦，后来就干脆用手来拿胶，半个月后，手痒痒的不得了。
俺怕了，俺想 干这活还是保命为先。  
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发表于 2011-9-24 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室通常是将10mg/ml的eb加2微升，而且最好不要把枪头插入胶溶液中，否则枪头外面会沾比里面还多的eb，那样就太多了，效果还行。
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麻瓜[使用道具]
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发表于 2011-9-24 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我直接把EB加在点样的loading buffer里，意思一下即可，跑出来的条带还蛮清晰的，不知有人这样做吗？
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