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标题:请帮我看一下这对引物行不?

ha111[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请帮我看一下这对引物行不?

请帮我看一下这对引物行不? [转载]


刚开始做PCR,随便在文献上找了对引物,听别人说要到BLAST 上验证才行,于是拿去验证,却看不懂出来的结果.问周围的人也说不出所以然,毕竟大家都是搞临床的.郁闷!!现在总怀疑自己的引物不够好.哪位高手能帮忙指点迷津,不胜感激!!
上游:ACGCTCCTGCTCGGCTGGGT
下游:CGTCTGCTTCACATCCTTCA
另外一对为
上游:CCCCCACTGAAAAAGATGAG
下游:TCACTCAATCCAAATGCGGC
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你这是什么的引物，我在generunner上验证了一下，引物本身没问题，两对引物均无发卡结构，无引物二聚体形成，无内部的环，GC含量也可以。
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ha111[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真不知怎么感谢你才好!!真是雪中送炭！！可我总觉得我的第一个引物的GC含量太高了,不知你是否这样认为?我的第一个引物是组织因子（tissue factor）,第二个是内参beta-微球蛋白，能不能再冒昧的问一下：怎样证明这两对引物的正确性呢？谢谢！！
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ha111[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真不知怎么感谢你才好!!真是雪中送炭！！可我总觉得我的第一个引物的GC含量太高了,不知你是否这样认为?我的第一个引物是组织因子（tissue factor）,第二个是内参beta-微球蛋白，能不能再冒昧的问一下：怎样证明这两对引物的正确性呢？谢谢！！
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发表于 2011-9-24 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物的好坏吧？！可以用各种软件的，将引物与模板进行比对，验证它的各种参数性能，这样可以得到初步的认识。不过，最准确的当然是做了！实践是检验正确性的唯一标准。  
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
帮你看了一下引物，第一对引物应该没有问题，如下：
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=28881897&dopt=GenBank')
>gi|28881897|gb|AF487337.1| Homo sapiens tissue factor mRNA, complete cds, alternatively
spliced

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.042
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus
Query: 1 acgctcctgctcggctgggtc 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 56 acgctcctgctcggctgggtc 76

Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.17
Identities = 20/20 (100%)
Strand = Plus / Minus

Query: 21 cgtctgcttcacatccttca 40
||||||||||||||||||||
Sbjct: 307 cgtctgcttcacatccttca 288
软件分析PCR产物252bp GC%分别为70％、50％，退火温度为54.6℃，以引物合成Tm值计算为准
第二对引物其匹配基因如下，不能完全匹配。考虑你查的引物是否含酶切位点等原因，建议重新设计
Homo sapiens beta-2-microglobulin,Homo sapiens chromosome 15, clone RP11-292P13
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=21619743&dopt=GenBank')
一家之言，仅供参考
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白鸟之翼[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以用oligo6.44来评估你的引物  
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猫屎一号[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参照(GAPDH) : 5'-AAGAAGATGCGGCTTGACTGTCGAGCCACAT-3'
5'-TCTCATGGTTCACACCCATGACGAACATG-3'
gulang100先生,能帮我看一下这对引物可以不?非常渴望得到你的回复,不胜感谢!!
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我试了一下，应该没有问题
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=37730277&dopt=GenBank')>gi|37730277|gb|AY179885.1| Papio anubis glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA, partial cds
Length = 678

Score = 60.0 bits (30), Expect = 4e-07
Identities = 30/30 (100%)
Strand = Plus / Minus

产物长度229bp， GC％分别为51.7%, 48.3%

Query: 31 ttctcatggttcacacccatgacgaacatg 60
||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 260 ttctcatggttcacacccatgacgaacatg 231
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大虾米[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起刚看到你的帖子，我也是新手，只能给你建议，实验还得靠实践解决，而且丁香园高手很多，我想他们一定能帮你。我的方法见cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/725959')
不会复制网页上传，只好用笨方法粘贴
RID: 1078482747-32102-34552634192.BLASTQ3
Query= (60 letters)
Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,
GSS, or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)
2,098,438 sequences; 10,081,357,587 total letters
>gi|40226235|gb|BC014085.2| Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, mRNA (cDNA clone MGC:20338 IMAGE:4541305), complete cds
Length = 2096
Score = 60.0 bits (30), Expect = 4e-07
Identities = 30/30 (100%)
Strand = Plus / Minus
>gi|31644|emb|X01677.1|HSGAPDR Human liver mRNA for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
(G3PD, EC 1.2.1.12)
Length = 1272
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=00031644&dopt=GenBank')
Score = 60.0 bits (30), Expect = 4e-07
Identities = 30/30 (100%)
Strand = Plus / Minus
Query: 31 ttctcatggttcacacccatgacgaacatg 60
||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 476 ttctcatggttcacacccatgacgaacatg 447
Score = 46.1 bits (23), Expect = 0.005
Identities = 30/31 (96%), Gaps = 1/31 (3%)
Strand = Plus / Plus
Query: 1 aagaagatgcggcttgactgtcgagccacat 31
|||||||||||||| ||||||||||||||||
Sbjct: 19 aagaagatgcggct-gactgtcgagccacat 48

1: X01677. Human liver mRNA ...[gi:31644] Links
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