小中大【求助】ployA加尾法PCR U6引物加什么？
相关疾病：
白血病
各位老师，前辈，学生生首次做microRNA，遇到一个问题，特来求助。我做的是白血病细胞株的microRNA，首先用traka 的triziol 提取了细胞的总RNA，OD260/280 是1.83，浓度大概2.5ug/ul，用ployA加尾法做逆转录（也是traka的试剂盒 D035A），加尾和逆转录的过程是在一起的，没有加任何的特异引物，试剂盒有通用的逆转录引物，逆转录完成后就用染料法做定量，待测的microRNA用特异性的正向引物，反向引物也是试剂盒配的通用引物。内参选用U6，现在的问题是我的U6的引物应该只加正向引物然后反向用通用的引物吗？
实验的过程中发现待测的miRNA曲线都有出来，我的U6加特异性正向引物和通用反向引物，曲线跑不出来，当我改成U6加正反向都是U6的引物后就可以跑出来了，但是CT值一直不高，30以后。这是为什么？
还有一个问题是U6在ployA加尾的过程中应该也会一起加尾吧，按这个道理来说，U6也加尾了，我定量的时候应该是用特异性正向引物+通用反向引物的，为什么这样就跑不出来了？而改成特异性的下游引物后就可以跑出来了。
希望各位老师、前辈帮忙解答，**。
我的U6引物是：
U6-F ：5-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3
U6-R ：5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3
