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标题:RT-PCR如何设置对照？

smile_smile[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RT-PCR如何设置对照？

RT-PCR如何设置对照？ [转载]


看到文献上有阴性对照，请问如何设置，作用是什么？另外引物为什么要跨内含子设计？还是不怎么明白的说：（
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米囡[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看看《分子克隆》，里面有相关解释。
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发表于 2011-9-24 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
外显子才能经逆转录过程翻译成蛋白质。

我一般都用BETA--ACTIN做阳性对照。
有人喜欢用阴性对照，有人喜欢做阳性对照，这两种都可以的。
请看分子克隆第第三版642页。
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发表于 2011-9-24 13:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
外显子才能经逆转录过程翻译成蛋白质。

我一般都用BETA--ACTIN做阳性对照。
有人喜欢用阴性对照，有人喜欢做阳性对照，这两种都可以的。
请看分子克隆第第三版642页。

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请问楼上，BETA--ACTIN是直接从公司定的吗？？？是一对引物吗？？？它是阳性对照还是阴性，谢谢
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发表于 2011-9-24 13:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看到文献上有阴性对照，请问如何设置，作用是什么？另外引物为什么要跨内含子设计？还是不怎么明白的说：（

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阴性对照一般有2种方法：（1）使TRNA不经过RT过程而直接进行PCR，目的是验证标本种有无DNA污染。（2）反应体系中不加cDNA而是以buffer代替，目的是检验产物是否是引物二聚体或污染等。
阳性对照一般是用特异性的cDNA序列。
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼上，BETA--ACTIN是直接从公司定的吗？？？是一对引物吗？？？它是阳性对照还是阴性，谢谢

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BETA--ACTIN，理论上是在所以的标本中都有表达的，而且含量高且很稳定，所以一般用BETA--ACTIN来检查TRNA的质量。所以，个人认为，BETA--ACTIN不能认为是一种对照的。
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发表于 2011-9-24 13:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
理论上是在所以的标本中都有表达的，而且含量高且很稳定，所以一般用BETA--ACTIN来检查TRNA的质量。所以，个人认为，BETA--ACTIN不能认为是一种对照的。

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beta-actin可以做半定量PCR的对照？
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发表于 2011-9-24 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物要跨内含子的作用是排除DNA的污染的可能,因为如果有内含子, 基因组DNA的扩增片段和mRNA扩增片段大小不一,如果优化条件,如减少延伸时间,可以只扩增mRNA.
阴性对照如smilingfish所说.所谓阳性对照一般是指 RT-PCR kit所带的标准摸板和引物,目的是确定反映体系的正确性,如是否漏加了试剂.
BETA-ACTIN常用于半定量PCR,但是由于它的丰度较高,并不适合于稀有mRNA的定量,因为当稀有mRNA可以检测到时,BETA-ACTIN早已达到了平台期(半定量的点应选在两者都处于对数期时).所以建议使用丰度较低的管家基因作为半定量RT-PCR的的内对照.
更精确的定量应选择real time或竞争PCR.
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发表于 2011-9-24 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起，才看到你的问题。
BETA--ACTIN是一对引物，可以自己设计比较经济，当然也有商品化的。
它是阳性对照。正如楼上所说，用BETA-ACTIN是存在不精确的问题，即它在各种细胞中的表达丰度很恒定，在提取表达丰度较低的基因时不是一个好的阳性对照。

理想的阳性对照由一种已知量的合成RNA体外反转录为一种克隆化的发生突变的靶DNA的一个片段组成。这种精确的靶RNA标准样品最好与实验管的靶RNA样品仅差异一个或两个碱基，这样RT-PCR扩增样品能产生一个至多个新的限制性酶切位点。靶RNA与标准RNA样品两者应该能用同一对引物进行PCR扩增。扩增后两种PCR产物能用限制性内切酶消化与琼脂糖凝胶电泳鉴别。

我对中间这句话没有理解上去，究竟在提取表达丰度低的目的基因在做RT-PCR时，用什么做阳性对照的好？？（我没有买一步法的试剂盒）。

毕竟阳性对照比阴性对照说明的问题要多。谢谢
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-9-24 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
理想的阳性对照由一种已知量的合成RNA体外反转录为一种克隆化的发生突变的靶DNA的一个片段组成。这种精确的靶RNA标准样品最好与实验管的靶RNA样品仅差异一个或两个碱基，这样RT-PCR扩增样品能产生一个至多个新的限制性酶切位点。靶RNA与标准RNA样品两者应该能用同一对引物进行PCR扩增。扩增后两种PCR产物能用限制性内切酶消化与琼脂糖凝胶电泳鉴别。

我对中间这句话没有理解上去，究竟在提取表达丰度低的目的基因在做RT-PCR时，用什么做阳性对照的好？？（我没有买一步法的试剂盒）。
谢谢
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