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标题:【求助】全血抽提rna应注意些什么啊？

fei1226com[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】全血抽提rna应注意些什么啊？


我是刚进入实验，准备做RNA的FQ-PCR。先准备从病人血提RNA，用RBC裂解液收集WBC，提RNA，反转，PCR，电泳看看效果。可每次总是不理想。RNA量很少，有时甚至没沉淀。不知错在哪环节。RNA很不稳定，提取时应注意什么呢？必须是新鲜血立即做吗，-80度冻过能提出来吗？病人就快来了，可提的不理想。急啊！请各位前辈给点建议：（
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vera+[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应用10ml抗凝血,经RBC溶解后(尽量无红色),用Trizol 1ml提取RNA,一般RNA的量较低但可以做RT了
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么不用淋巴细胞分离液来分离出白细胞呢？这样做效果会好些。一般主张新鲜血立即分离出白细胞，然后加Trizol试剂。加完Trizol试剂后可以立即做RNA的提取，也可放入-80度冰箱中保存，但最好不要不做任何处理就冰冻储存起来。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5ml血够不够啊?
因为现在探针还没来,没法做FQPCR,必须先把血冻起来,可我试过冻一周后就抽不出RNA 了好象.冻RNA好象也难保不降解吧?
用RBC裂解液好象比淋巴细胞分离液能多提些WBC吧?是不是从血抽RNA就比较难,郁闷!
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okhaha[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提取RNA要注意的一些事项外，提取全血RNA要特别注意强调2点：
1.全血标本一定要分离出白细胞，并且尽量不要采用直接裂解RBC方法，而获得WBC
2.全血标本要在2小时内分离出白细胞，不可采用如低温冷冻、冷藏等超过2HR后才分离出白细胞方法，
上诉2点主要是由于血中含有丰富的RNA酶，导致RNA容易降解。
5ml血提取的RNA通常够实验用！
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finger[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也有相同的问题：弱问一句，红细胞中没有核，还有RNA吗？能告诉我一个联系方式吗？多谢。
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得没那么严格,因为我正在做这方面的工作,1ml血就够了,关键是操作步骤严格无菌,还有就是异丙醇沉淀那步,一定要在-20度放一小时,还有吸取RNA的时候不能贪心,不能吸到DNA和蛋白质,血最好是新鲜点的,时间久了,有时也能提出,但效果不佳
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ujne[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是学血液的，提的一直都是外周血和骨髓的RNA，正常人和病人的都提过，感觉还不错，现在成功率几乎可以达100%，而且RNA质量很好。总的说来，血液的标本要比组织的好提多了(因为组织中含有丰富的RNA酶)，外周血比骨髓更容易些，也不会那么快降解。有下列几点在抽提白细胞时是要注意的：
1、收集新鲜抗凝血，正常人5~8ml足够了。
2、收集后最好在4小时内把白细胞分离出来，否则细胞自溶，RNA就降解了。血样放在室温或37度下，但不能冻存。
3、用淋巴细胞分离液提出白细胞比较好，分离时血样一定要贴壁加在淋巴细胞分离液的上面，混匀就无法分离出来了。另外离心机的转速也要考虑，能不能达到它显示的速度，分离时要求的转速是2000rpm/分×20min。我有个同学因为离心机转速达不到，分离效果始终不佳甚至不能分出中间的一层，换了一台机子后就好了。
4、吸取中间一层白细胞层时可以尽量多吸，当然不可避免地会把血浆中的蛋白质也吸进去，可以用0.02M的PBS洗涤2~3次，每次3~5ml均可，最后一次用1ml的PBS装入1.5ml的EP管里收集细胞沉淀，尽量吸尽液体，然后加入1ml的Trizol吹打混匀。想接着抽提RNA就可以往下做，不想立刻做的话，可以先放在-20度保存等到收集一批样本后一起提RNA也可以。我做过一个月没问题，都能提的很漂亮。
5、操作过程不需特别强调无菌，除非你收集细胞是用来作原代培养的。只要离心管、 吸管、PBS、EP管、Tip头高压灭菌就可以了。
6、RNA抽提以前我也总结过，可以在版子里搜索一下，有很多关于RNA抽提的注意事项，今天就不多写了。
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发表于 2015-11-10 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
……还有就是异丙醇沉淀那步,一定要在-20度放一小时,……

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为什么试剂的说明书都说室温下 10分钟？？？omega 和invitrogen的都是这样
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iii_ii[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我没用过试剂盒,我曾经在室温下十分钟用异丙醇沉淀,但总是不理想,但-20度放一小时后结果就非常好
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