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标题:【求助】第一次作RNA提取及RT－PCR的新手向各位专家请教!

sunnyB[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】第一次作RNA提取及RT－PCR的新手向各位专家请教!

从来没有接触过RNA的新手，准备从外周血淋巴细胞中提取RNA，然后进行逆转录，进一步通过PCR获得目的基因。虽然看了不少资料，可还是心里没底，不知道哪个地方会遗漏，导致实验失败。现将自己看过资料后的心得，还有疑问提出来，恳请各位专家不吝赐教！
1、需要准备多少静脉血。类似实验，有人抽了5个人，每个人都要50ml血。不知道是不是必须要这么多？总体积要达到多少，才能获得足够量的淋巴细胞？
2、标本保存。我的标本无法一次收集，看丁香园上有专家说应该每次收集到标本，就分离淋巴细胞，并且加Trizol试剂，然后冻存，待标本都收集好，再一起提取RNA。请问，冻存前加入Trizol好，还是不加入好？加入Trizol的量如何计算，保存用的EP管需要用DEPC处理吗，－20℃保存可以吗，最长可以放多长时间？
3、淋巴细胞分离。我们医院有淋巴细胞分离计数这一个检测指标，我直接用他们的仪器、方法是不是就可以？
　先请教这么多。对于以上疑问，希望能有专家早日解除我的疑惑！
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qqq111[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是组织的RT－PCR，但是我们实验室有人做的是血液淋巴细胞的。我看到他们都是血样直接冻存就可以啦。－20度，最好是-70度，比较好。当然最好就是拿到血样，立即分离淋巴细胞然后提取RNA，如果要做RT，就可以先逆转录，这样，cdna可以保存半年不成问题。我没有用过淋巴细胞分离机，但是我看到我们实验室的同学用的是淋巴细胞分离液，不知行不行。外周T淋巴细胞的含量是淋巴细胞总含量的5－10个百分点。所以根据你的需要量看看多少血就够了。如果做RT，好像用不了这样多的血。我们实验室好像5毫升就够了。我们提取RNA用的是美国的试剂，所以对trizol不太了解。我知道的只有这样多。具体不知道你提取RNA的用途，所以不敢多说。
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gogo[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚好我也做这样的试验,对于你的问题给出几点看法吧：1、如果是做RT-PCR的话，一般是不要50毫升的血，我用6毫升就可以提到足够的RNA（用ficoll-hypzue法，但是确切的说提到的是单个核细胞，使用此法一毫升可以提到多少个淋巴细胞你可以查一下书，我一时记不起来了，因为此法上本科的时候就有做过这个试验，一般的免疫实验书都有）。2、分离到淋巴细胞后最好加入TRIZOL，然后-20度，最好是-70度冻存，要不然RNA会降解，因为TRIZOL试剂内含有抑制RNA降解的成分，我也曾经将淋巴细胞冻存，过两周后去提发现降解好厉害，而加入TRIZOL后要好很多，可以保存6个月左右；一般TRIZOL都是加1ml，枪头和EP管最好用DEPC处理，但是一次性使用的话，根据我们的经验，高压一下就可以，当然前者更为保险；3、淋巴细胞还是自已分离的好，我不知道你要不要记数，但分离淋巴细胞并不难，而且RNA的试验最好一步到位，检验科测的淋巴细胞分离计数（血常规中的）和提RNA用有所不同，你最好到检验科问清楚他们提取方法。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢两位的指点。因为我的实验是要构建文库，所以我想等样本多收集一些后再混合起来做RNA提取。这样子，每个人的血量就可以少一些。如果只需要几毫升，应该问题不大了。
淋巴细胞的分离，我也是听说了一下，并没有详细去咨询过检验科。看来，还是自己做比较好。我看别人做RNA提取前都做计数啊，所以我想我也应该去做一下，心里有数，加入Trizol的量也好定吧。楼上说：一般TRIZOL都是加1ml。不管多少淋巴细胞都是加这么多吗？我想应该和获得的淋巴细胞数量相关吧。
还要请教一下，我现在还在筹备阶段，看到好多地方都在卖RNA抽提的试剂盒。我想，是不是用试剂盒保险一点，哪怕多花一点钱，起码不会浪费标本。不知道哪个公司的试剂盒质量又好，价格又不会太高呢？
另外还要请教楼上，我收集标本时，用肝素抗凝可以吧？有些人说会影响后面的RT-PCR。不知道你做实验时用的是什么抗凝剂啊？
实验室以前也没有人做过RNA，现在要准备试剂什么的，感觉需要好多东西，不知道最关键的，影响力最大的试剂或者器材有什么？还请各位专家多多指点。非常感谢。
希望版主为楼上两位加分，不甚感激！
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发表于 2015-11-10 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

trizol的量是根据细胞的量来的，一般1ml对应5*10e6的细胞，，细胞太多效果反而不好，会有蛋白和DNA的污染。试剂盒的效果不一定比trizol好，因为很多的原理都跟trizol差不多，不过由于一般都还采用硅胶吸附的过程，产量稍高一点。如果用进口试剂盒的话，qiagen是首选；ambion是专门做RNA的，应该也很强，不过没用过；invitrogen也可以考虑。不管用什么试剂，整个操作过程中都要避免RNA酶的污染。DEPC怎么都要准备一点。
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发表于 2015-11-10 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以用肝素抗凝,我就是用肝素,没有发现它会影响后面的RT-PCR。至于RNA的提取，invitrogen的TRIZOL比较好些，买试剂盒，如果你有钱的话，但是RNA的提取没几步，我看没不必要吧。楼上的说得对，提取RNA最关键是不要被RNA酶污染，至于如何防止，我看你要看相关的书，这里不一一叙述了，还有，你有条件要看看人家如何做，因为实际做起来心里才有点底。提取RNA后有条件要逆转录到c-DNA，c-DNA比RNA要稳定得多，这样可以保存更长的时间。所以标本的保存最好是提取到淋巴细胞后加入TRIZOL，或者逆转录到c-DNA保存，再等收集到一定量后进行PCR。另外一个建议：RT-PCR采用二步法，以利于摸索PCR的最优条件。一点浅见，希望对你有帮助。
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发表于 2015-11-10 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，去年我就负责做了这样的一个全过程实验，用的是10mlEDTA抗凝的全血，由于是需要将PBMC培养，所以在6h内分离PBMC，当然即使不培养也最好尽快分离啊。然后收集的PBMC用MRC公司的TRI reagent 1ml于-70度冻存的，理由和前面几位说的一样。做RNA 好象也没有那么玄乎，只要平时注意习惯，尽量避免污染等等防止RNA降解的方法就可以了。
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发表于 2015-11-10 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的感觉是
１EDTA抗凝比肝素抗凝分出来的细胞量多
２若用ｆｉｘｃｏｌ分PBMC离心出来细胞弥散也没关系，可把ｆｉｘｃｏｌ层全吸出来，用５倍以上的PBS洗，多洗几遍
２我用２ｍｌ的全血分出的细胞做定量结果挺好的
３我们提RNA不用试剂盒效果也不错，且发现若细胞量过多提出的RNA质量反而不高
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
结核病
非常非常感谢各位专家的指点！
我觉得“你有条件要看看人家如何做，因为实际做起来心里才有点底。”这句话太有道理了。有机会我一定要去实际看看别人到底是怎么做的，这样子就不会心虚了。
不过，看到这么多人对我的热心帮助，我已经信心十足了。就算出现问题也不怕了，有这么多专家在这呢，到时候，相信大家一定会帮助我渡过难关的。
还是那句话，非常感谢大家！希望版主为热心的人加分！
还有我是作结核的基础研究，大家有什么问题，我们可以互相交流，我非常愿意为大家服务。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教各位专家，今天第一次做RNA提取，就遇到好多问题。
下午收集血液后，拿申能博彩的试剂盒提取RNA。
在第一步加入红细胞裂解液，离心，弃上清，可以看到明显的细胞沉淀，可是血红蛋白也很多，我怕影响后面的细胞裂解，就拿PBS洗了两次，可是洗了两次，还是有红色的沉淀。我就直接加入试剂盒中第二步提到的细胞裂解液了，变成了咖啡色，我用振荡器混匀，看不到沉淀后，因为时间关系，放到了-20度冰箱，保存，准备明天接着往下做。
不知道我今天做的这两步，是不是问题很大？血红蛋白是不是一定要全部洗干净？我放到-20度冰箱保存，会不会影响RNA的提取？
非常需要各位的帮助。非常感谢。
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