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标题:【求助】Tm值怎么计算?

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发表于 2015-11-11 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Tm值怎么计算?

各位大侠我是一个新手,才做PCR不久,遇到不少问题,
⑴Tm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ），这Ｇ\C\A\T是分别代表它们的数量吗?
⑵如果设计上下游两条引物,但两个Tm值相差很大，一个７４.8一个63.7该怎么选择退火温度,还有要批的东西在1600bp以上,延伸时间该有多长啊
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duchy[使用道具]
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发表于 2015-11-11 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通常以连续与模板互补的碱基个数用以下公式计算:
Tm=(A+T)X2+(G+C)X4
然后再减5度左右就可以当成退火温度了。
但是看你已经合成完引物了，所以用报告单上的Tm比较好，上面的公式只是粗算了。
tm差得多用小的哪个p。建议先试试55，58和60度。
延伸时间和你用的酶有关，高保真的慢，时间长，一般的taq快时间短，你看看酶的说明书就知道该怎么算了。
祝实验顺利
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发表于 2015-11-11 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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46XX性发育睾丸疾病
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> Primer Name %GC Strand Size (bases) Tm (°C)
> CHRNA7 1 F 50.00 FWD 20 59.96
> 5' Addition a t c g a t g t a c g c t g g t t t c c
> CHRNA7 1 R 55.00 REV 20 60.24
> 5' Addition g g c g a a g t a c t g g g c t a t c a
>
> 你好，这个因子我已经试了很多温度，还是不行，46和48度有条带，条带大小是200多和设计上写的好像有出入，而且很淡，升高温度后什么也没有。可以帮我算下温度吗，谢谢真的很急
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发表于 2015-11-11 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病
哦，你能不能说详细点了。我觉得这对引物应该很好p吧？46，和48的条带也不是你要的1600，忘记它吧。
能不能具体说说55，58，60的情况是什么样的，什么都没有吗？
你p什么东西？基因组还是质粒？
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发表于 2015-11-11 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
发现新提问的朋友和楼主不是一个人的说。PM把我P迷糊了都。
引物报告单都出来了还算什么TM啊？不是写的59。96和60。24 吗？
选50-55度先p着吧。不要光考虑温度，其他条件也要看啊。
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发表于 2015-11-11 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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46XX性发育睾丸疾病
的确我不是楼主，我是看到你和别人说的温度。所以也请你帮忙。我做的基因组的。之前从46到60跑过梯度什么没有，也跑过58，54，60什么都没有。昨天从46，48，50，52，54，56都跑了，就46，48有很淡的条带，其它没有。我给你看的是设计的温度，引物合成单上上下游各有2个温度，是按钠离子浓度不同分的，写的是46，48度左右，再个是59，60度。
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发表于 2015-11-11 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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建议如下：严重怀疑引物报告单有问题，想不明白怎么出来的46度和48度。这两个引物都应该是60度左右的。如果不行重新合成下引物吧。在等这个引物的过程中可以试试在52和55度的条件下调节别的条件，你现在既然把所有的温度都试了，还是没带，就别盯着温度看了，可能是别的原因了。
多说一句是第一次做pcr吗？有没有人指导下体系中各种东西都加多少？问问身边的人看看有什么建议。
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发表于 2015-11-11 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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今天脑袋狂大，净说错话，才看明白plovexi的意思，是按钠离子浓度分分别一个是46，59，另一个48，60的意思吧。呵呵。
摸下别的条件吧。温度先放在52度，比较保守了。
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duchy[使用道具]
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发表于 2015-11-11 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，是我说的不清楚啊。今天跑了60，62，64，把昨天的54，56，57，58，也都跑了电泳好像都有条带，以62和64为亮些，可按MARKER的位置片断只有100多BP啊
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发表于 2015-11-11 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哎，跑出了传说的引物二聚体。
你为什么非和温度斗到底啊？你把你别的条件贴上来大家一起看看吧。
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