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标题:【求助】MASCOT鉴定到的位点在质谱

今生如此[使用道具]
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发表于 2015-11-12 14:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】MASCOT鉴定到的位点在质谱

为何在做磷酸肽鉴定时，MASCOT鉴定到的位点在质谱上没有对应的峰呢.如下图MASCOT鉴定到文献描述的1031处的峰，在质谱图上却没有对应质荷比的肽段，求大神帮助，感激不尽。


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发表于 2015-11-12 14:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

质谱不一定就在磷酸肽的磷酸基位点处切割，很多时候要用MS-MS才能测定出特异的修饰位点。
确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计：凌波丽个人总结之二
cuturl('http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=6739957')
上文中有利用质谱进行修饰基团测定的材料，并且富有具体参考资料。
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发表于 2015-11-12 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

谢谢您的指导哈，您的总结之中好像没有磷酸化那部分，是不是将肽段进行特异修饰，才能在磷酸基位点处切割啊。
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jishiben[使用道具]
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发表于 2015-11-12 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

蛋白质的共价修饰的测定的试验方法-----凌波丽个人总结（实例版）
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dadaai[使用道具]
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发表于 2015-11-12 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

专家，我好像还是不知道该怎么解决问题，二级中如果能鉴定到位点，那一级质谱图中应该有相应的肽段呀，而且我只鉴定到三条肽段中的两条，您知道该怎样解决吗？希望可以得到您的帮助。
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发表于 2015-11-12 14:35 资料  个人空间 短消息  加为好友 QQ

 小中大

【回复】

:rol:测分子量有什么用??? .....知道分子量就能知道这个是什么蛋白质了??
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发表于 2015-11-12 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

话说.....我的载体带了那个his的标签,,
然后重组蛋白纯化用IMAC,,
多肽的纯度和数量的确定 用SDS-PAGE,,
蛋白质的鉴定用 western blot ....
:rol: 这个连线题我做对了么??
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jishiben[使用道具]
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发表于 2015-11-12 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

首先，楼主最好找本比较基础的蛋白质相关教科书看看，这样你能有比较清楚地认识
BCA或者Bradford Assay是蛋白质定量法，这个定量是测定样品中有多少蛋白，譬如每毫升样品多少毫克之类，蛋白是具有活性的物质，在你研究他的功能之前，至少得先知道样品中有多少。
SDS-PAGE是将蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，由于不同分子量大小的蛋白泳动速度不一，因此对照marker（就是一系列不同分子量蛋白）可以较粗略的估计分子量。如果要精确点的结果，就需要上质谱。
western blot即蛋白质印迹，是利用抗原抗体特异性反应鉴别蛋白的，譬如一份样品中有很多蛋白，但你想知道有没有某蛋白A，那么就找针对A某段序列的抗体，通过特异性反应，抗体与样品中蛋白A结合，在通过一定的二抗，就可以进行检测。
另外，你的连线正确
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886爱[使用道具]
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发表于 2015-11-12 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

用Histag的柱子纯化得到蛋白，因为你的蛋白有histag标记，所以只有有histag的蛋白才会吸附在柱子上。通过洗脱可以得到目的蛋白。
然后用BCA或者Bradford Assay，测量quantify 得到蛋白的浓度，大概有多少蛋白
再用 Western-Blot 通过特异结合目标蛋白的抗体，identify是不是真的是目标蛋白。
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大嘴猴[使用道具]
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发表于 2015-11-12 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

其实我也很想找本书来认真的看,,
:cry: 可是我1个月后交作业,,同时还要考期末....
然后下学期就不用学分子生物学了
所以.....好吧!!我还是会很努力地学的哈哈....
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