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标题:【求助】贴壁细胞的软琼脂克隆形成实验

queen[使用道具]
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发表于 2015-11-14 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】贴壁细胞的软琼脂克隆形成实验


各位战友请教大家一个问题：
贴壁细胞的软琼脂克隆形成试验，如果形成了克隆，应该是怎样的形态阿？
谢谢大家的帮助!
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greenbee[使用道具]
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发表于 2015-11-14 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正在做这个，也有同样的疑问。
现在做了两次了，第一次细胞只是悬浮在gel中，好像用trypsin消化后的状态，圆形的小亮点，过了两个星期还是那样，也不知道是死的，还是活的。不过我想应该是活的，死的那么长时间都应该裂解了。
但是第二次很有意思，有些细胞已经贴附在下层agar gel上生长，就像在dish上长的一样，形成了克隆。
不知道怎样的是正确的。而且protocol上讲的用crystal violet染色后记克隆数又有什么意义，不染色也可以计数呀？
哪位高手可以给解答一下，多谢！
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greenbee[使用道具]
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发表于 2015-11-14 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同问，我做的软琼脂克隆2周后细胞都渐渐裂解或是成了黑色的小圆球了，少数存活的也是圆形的小亮点，没有增值的迹象，我用的是SK-HEP-1，我一师妹做HepG2结果也差不多，是不是软琼脂克隆不适于铁壁细胞啊？？？
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发表于 2015-11-14 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先应该理解soft agar的原理：就是让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞transform的能力。
单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。
如果有人观察到细胞呈贴壁状，那么很不幸，您的soft agar没做好，细胞落到培养皿底了，您需要重做，呵呵。
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发表于 2015-11-14 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我目前做的在镜下已经可以观察到克隆（附图），但是仍有一些问题
1.文献上说只有大于50个细胞的克隆才应该计数，可是如何判断克隆中的细胞是否大于50个呢？是不是这样的克隆不用借助显微镜，用肉眼就能看到？
2. 如何从软琼脂中将克隆挑出来？我试了好几种方法都不行。
哪位高手可以帮忙，感激不尽！


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qqq111[使用道具]
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发表于 2015-11-14 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我遇到和你同样的情况，一般到2周左右还是可以在镜下看到克隆。但我的克隆分布不匀。不知你有图片么，可不可以分享下。我有些自己做的克隆的图片。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2015-11-14 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是我的图片，可否分享一下易得具体做法。我做了快两个月了。觉的自己的方法还需改进。


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发表于 2015-11-14 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了一次，三周后看到了克隆，但数量不多，没有我种上去时的密度的50%，我种的六孔板，密有三个梯度，1000、1500和2000，师姐说课能是由于温度太高，所以长的密度不够，但我发现在做时，如果温度低了会出现所铺的胶很不均匀，照相时也不好看，各位还有什么意见一起分享分享。还有你们是在多少倍下照相，我想看实验组和对照组的克隆数多少，但是照相机照出来总觉得就是一个点一个点的，没有显示出大概的克隆形态，显微镜下最校也是5倍，也不能照出整个六孔板的1/5.各位有什么好点是建议？
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发表于 2015-11-14 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通常下层快些铺，略有不平是没有太大关系的，上层与细胞混合时水浴不大于40度，小心均匀的铺，37度不会那么快凝固，孵箱里过几天就好了。半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。
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发表于 2015-11-14 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先应该理解soft agar的原理：就是让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞transform的能力。
单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。
如果有人观察到细胞呈贴壁状，那么很不幸，您的soft agar没做好，细胞落到培养皿底了，您需要重做，呵呵。
......

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不太认同说法，个人认为SOFT-AGAR实验不是为了检测细胞的transform能力的。
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