小中大【求助】3T3-L1的分化问题
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最先开始是用实验室师姐留下来的3t3-l1分化，分化率不高而且细胞容易飘起，后来经过hochest染色才发现细胞早已感染了支原体，所以后来重新购置细胞
我买的是万邦医药的胰岛素注射液，猪源的。效价是10ml=400单位，按百度的国际单位1单位=0.0155毫克的功效，配成10mg/l，其余为sigma
1000x IBMX (0.5M): MW=222.25, 0.5M=111mg/ml in DMSO
1000x Dex (1mM): MW=392.46, 1mM=0.39mg/ml in EtOH
1、3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞
3T3-L1小鼠成纤维细胞置于含10%FBS的高糖DMEM培养基中，37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养。步骤如下：
1）试验时以2.5×104/mL的密度接种细胞于24孔板中（接种于24孔培养板，每孔细胞浓度为1×104个mL-1，每孔体积为600 μl，），待细胞长至60%开始分化；
2）用分化液1含0.25 m mol/L 异丁基甲基黄嘌呤（IBMX），5 ug/ml 胰岛素，
1u mol/l 地噻米松，10%FBS，高糖DMEM培养液培养2天；
3）再用分化液2含10ug/ml胰岛素，10% FBS高糖DMEM培养液培养2天；
4）含10% FBS高糖DMEM培养液，每天换液一次；
5）8-10天，细胞呈脂肪细胞表型，可看到脂滴；
6）14天以后分化率达90%以上的细胞才可以使用。
Ps: 24孔每孔500ul 12孔700~800ul 6孔板加1ml 20%~30%铺进去，隔天长到60%一下即可开始分化。
大约12500个细胞每孔
一个10cm的长满细胞的培养皿可以分三四个24孔板。
24孔板孔较小细胞不易混匀，要多混匀下，若没有混匀细胞容易长拈连在一起。
隔天待其长到60%即要开始分化，若分化液变黄要及时换液，加完分化液Ⅱ两天的时候换高糖完全培养基，若细胞长得太满可直接拿去油红染色，测糖摄取要求细胞长满再测糖摄取。
早期遇到的问题：
1.有的孔细胞容易聚集在板四周，中心不容易长细胞。 是因为没混匀？？
2.最初小黑点很少，但是第四天后小黑点就开始长起来了 换诱导液2时可以PBS清洗细胞吗？
3.细胞在第三天开始在孔中央有空泡状漂浮物，看的贴不牢的感觉
4.到第六天时候细胞开始从孔的四角，以面皮状态开始漂浮
5.第9天染色，不见像样的大脂滴
