【分享帖】细胞调亡与坏死鉴别的简便方法

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标题:【分享帖】细胞调亡与坏死鉴别的简便方法

mercedes[使用道具]
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发表于 2015-11-16 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞调亡与坏死鉴别的简便方法：
1。PI和Hoechst33342双标：
PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。
故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。我最近在作的试验就是用的这种方法，附上一张我染的PC12细胞的图片，请大家指教。更精确的定量可以通过流式细胞仪来检测。
用PI和Hoechst33342双标鉴别调亡、坏死，这种方法简便易行，结果比较可靠。
2。PI和Calcein-Am双标：
Calcein-AM 是一种绿色荧光标记物，可显示胞浆，为膜通透性的荧光染料。Calcein-AM 一旦进入胞内，便可被内源性酯酶水解成绿色荧光物质calcein, 并保留在胞浆中。细胞处于调亡时，由于核成碎片状，从而使此时的胞浆的calcein着色呈碎片状，但是PI为阴性。细胞坏死时，胞浆的calcein染色基本上属于正常，但是PI为阳性，有时可以看到膜内有空泡。但是晚期调亡细胞，胞浆有calcein着色并呈碎片状，而且PI为阳性。
3。PI和Annexin-V双标：
Annexin-V（green）可以和胞膜内的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。正常细胞膜的磷脂双分子层排列整齐，但是如果细胞损伤时，酯脂双分子层的排列就会被打乱，内层的可能会翻转到外层，Annexin-V就可以检测到这种现象。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性。
可用confocal来进行双标观察计数或流式细胞仪定量检测。
4。Leukostat染色：
活细胞Leukostat染色，核呈棕色，胞浆透明；调亡细胞核浓集，呈黑、褐色，变小，胞浆不可见；坏死细胞溶解呈空壳。
这种方法现在少用。
补充：鉴别细胞调亡与坏死的方法挺多，但大多比较繁琐，我总结的这几种方法则是简便易行，最适合于经费比较紧张的研究生们。

附件

2015-11-16 15:56

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seagate[使用道具]
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发表于 2015-11-16 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

受益很多，我对Annexin-V和PI 双标比较感兴趣，能具体讲讲怎么染吗？我用的是HeLa 细胞。另外，怎么分辨晚期凋亡的细胞和坏死细胞呢？

whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-11-16 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常漂亮。能问一下你所用的试剂要求高吗？国产的试剂能做出这样的效果吗？

mercedes[使用道具]
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发表于 2015-11-16 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

针对以上朋友的提问，回答如下：
1。试剂来源：
PI和Hoechst33342都是sigma公司的粉剂，不是kit，
2。具体方法：
将PI和Hoechst33342的终浓度调到10μg/mg就行，用PBS，Hank's液、生理盐水或D液任何一种溶解都可以。Hoechst33342染色37℃10min就达到饱和，PI在4℃10~20min就行。
3。文献出处：
A，《细胞实验指南》上册，p102－125，现代生物技术译从－－科学出版社，
B，有好几篇文献，只列出其中的一个：
         Ha HC, Snyder SH.
         Poly(ADP-ribose) polymerase is a mediator of necrotic cell death by ATP depletion.
         Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Nov 23;96(24):13978-82.
         PMID: 10570184 [PubMed - indexed for MEDLINE]
         全文链接：cuturl('http://www.pnas.org/cgi/content/full/96/24/13978')
鉴别晚期凋亡和坏死的方法我还没有找到，但是这两者要区别是比较困难的， sorry！

cocacola[使用道具]
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发表于 2015-11-16 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我正在从事细胞凋亡方面的研究，我选用了丫啶橙染色和Annexin-V/PI双染色作为细胞凋亡的形态学检测方法，你如果感兴趣，请来信至yanjie_zhang@yeah.net，我可把我所拍摄的照片发给你。

qhyu[使用道具]
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发表于 2015-11-16 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了您的贴子，受益匪浅。我现在有一个关于hoechst33342的问题，非常棘手，望不吝赐教。
我的研究方向是干细胞移植，现在实验已经完成。主要是在体外将移植细胞以hoechst33342染色，而后植入体内。2周后取标本复查，荧光很好，而且非常密集；但4周后再检查的时候，荧光却踪影全无。我对这种现象很难解释。可能的原因不外乎：1、细胞死亡，2、细胞排出染料，3、染料荧光自然衰减，或发生猝灭。但查了查有关资料，一直没查到hoechst33342的荧光寿命，以及在什么条件下会猝灭。
不知您可否在这方面给与帮助，谢谢。
BTW: 我在北京，平时可以多切磋。

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发表于 2015-11-16 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 qhyu 于 2015-11-16 15:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看了您的贴子，受益匪浅。我现在有一个关于hoechst33342的问题，非常棘手，望不吝赐教。
我的研究方向是干细胞移植，现在实验已经完成。主要是在体外将移植细胞以hoechst33342染色，而后植入体内。2周后取标本复查，荧光很 ...

我对您的问题谈一些我的看法（个人观点，欢迎讨论），
首先我对细胞（包括干细胞）移植后的存活问题始终存有疑虑：且不说移植后的免疫排斥问题，我们谈谈细胞的外部生存条件：培养细胞在体外有充足的营养供应，有它适合生存的培养基及介质，然而到了体内它周围有什么？条件自然比体外要差的多。所以我认为不解决移植细胞在体内的存活问题，那么移植的可靠性和实用性就会大大折扣！
我曾经用绿色荧光蛋白（一种标记细胞浆的荧光染料）标记嗅鞘细胞（体外观察很好），但是把它移植到正常的脊髓中，confocol结果发现一堆绿色的乱七八糟的小渣子，根本没有细胞的形态，但是用hoechst33342标记的，仍然有不少表面上显示正常的核的结构。从这一点上我们可以得出－－这时细胞的状态并不正常！虽然它们的核仍然完整。
下来谈谈hoechst的问题，hoechst是一种核酸特异性染料，与A－T键优先结合。因此在正常情况下hoechst荧光寿命的时间应该是较长的，直到A－T键被破坏。所以说荧光消失的问题就很可能是细胞死亡后，被周围的巨噬细胞吞噬消化掉的结果（如果没有完全消化，就仍然有荧光的显示）。

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发表于 2015-11-16 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那种方法比较便宜阿
楼上的大哥？
我没多少钱啊
谢谢

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发表于 2015-11-16 16:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那就来个最便宜的AO/EB法。不用花钱。
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=26913&h=1&bpg=2&age=0')
也许用得上。

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发表于 2015-11-16 16:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #9 finger 的帖子

谢谢
我已详细读过
为什么在首帖里没有提到这种方法呢？
是不是它有什么缺点呢？
因为有毒性吗？

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