PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 5‘ RACE

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 16  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:5‘ RACE

幽兰君[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 73747
精华 0
积分 131
帖子 41
信誉分 100
可用分 906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
1

发表于 2011-9-27 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5‘ RACE

5‘ RACE


请问：：
5’ 3‘ 端未知区域如何克隆（已知中间一段），除了5’RACE。 如果使用5‘RACE 应该注意些什么问题？ 请推荐，不吝赐教！ 多多交流！急等
顶部
魔法师A[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72007
精华 0
积分 131
帖子 42
信誉分 100
可用分 901
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-2
状态 离线
2

发表于 2011-9-27 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：
1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；
2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；
3、用巢氏PCR相对容易出结果；
4、如果出现多个条带，要分别验证；
5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；
6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
顶部
魔法师A[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72007
精华 0
积分 131
帖子 42
信誉分 100
可用分 901
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-2
状态 离线
3

发表于 2011-9-27 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：
1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；
2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；
3、用巢氏PCR相对容易出结果；
4、如果出现多个条带，要分别验证；
5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；
6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
顶部
=菓子=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71218
精华 0
积分 298
帖子 296
信誉分 100
可用分 2311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
4

发表于 2011-9-27 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两引物间要有100-200bp的重叠区 是什么意思？5’、3‘ RACE 你用的是哪里的盒子？我现在也在做5’RACE，试验正好卡在这了。还请魔法师A兄多多指教。
顶部
魔法师A[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72007
精华 0
积分 131
帖子 42
信誉分 100
可用分 901
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-2
状态 离线
5

发表于 2011-9-27 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是BD clontech Co的RACE SMART Kit，重叠区是指你设计的引物所扩的片段是100-200bp，但我们在做RACE的时候是用sense primer和接头引物扩3‘ RACE ，用anti-sense primer 和接头引物扩5’-RACE 。重叠区就是两设计引物所扩的片段，通常拿它做阳性对照。另外，后来测序时，可以用重叠区来验证你的结果。
顶部
幽兰君[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 73747
精华 0
积分 131
帖子 41
信誉分 100
可用分 906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
6

发表于 2011-9-27 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
“Tm最好大于70度，”请问，为什么引物的Tm值要那么高？是不是要与adaptorTM值接近些好呢？  
顶部
魔法师A[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72007
精华 0
积分 131
帖子 42
信誉分 100
可用分 901
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-2
状态 离线
7

发表于 2011-9-27 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这里有两个原因：
1、Tm大于70度，好做touchdown PCR；
2、相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。
顶部
阿福[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 69991
精华 0
积分 269
帖子 277
信誉分 100
可用分 2146
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
8

发表于 2011-9-27 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做同源基因克隆，通过RT-PCR，已经得到目的基因CDNA的一段，下一步要做5‘和3’－RACE，以拿基因全长cDNA,听说做RACE有一定难度，所以我很担心，请教yshu3507，
1：RACE对RNA质量要求较高，怎样才证明所提RNA是完整的？
2：BD clontech Co的RACE SMART Kit多少钱，能做多少次？好用吗？
3：为什么要做Touchdown PCR?
4：还有什么要注意的细节吗？
5：能告知你做RACE的具体程序吗？。。。
望不吝赐教，不胜感激！
顶部
babybabe[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72893
精华 1
积分 275
帖子 226
信誉分 102
可用分 1936
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
9

发表于 2011-9-27 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
魔法师A
你好啊 ! 我也准备5'race 但是什么叫touchdown PCR 我搞不太清楚 请赐教!
顶部
庄梦蝶[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72138
精华 0
积分 142
帖子 63
信誉分 100
可用分 1006
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
10

发表于 2011-9-27 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我记得我专门发过一个文件来扩增已知一段中间序列来调前后序列的。
方法大概可以参照常规的 protocol.

关键在于中间一段已知序列的利用。用这个片断来筛选目的产物，可以达到事半功倍的效果。设计的时候在这段再多设计一个引物，上游或下游，产规扩增出产物后连接到TA载体中间，用已知序列的这段来筛选，一般拿到的就是你要的。

有问题再联系我。

touchdown PCR 是退火温度一步一步降低，这样开始的是特异性高的目的片断，到后来目的片断增加后，降低退火温度来提高产量。非特异带再开始高温扩增少，后面温度降低时，特异带产量已高于非特异产物，最后特异产物再最终产物中占优势。
顶部
 16  1/2 12››