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标题:【求助】目的基因和内参基因的Ct值差太多

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2015-12-1 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】目的基因和内参基因的Ct值差太多


我在进行real time PCR相对定量时，使用的是SYBR Green染料法。不管怎么稀释模板，内参基因和目的基因的Ct值总是无法同样处在有效范围内，比方说内参基因的Ct值在15~30之间，而目的基因的Ct值过大（大于35），或者过小（小于15），这种情况该怎么办？
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发表于 2015-12-1 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
每次扩出来的ct值肯定是有出入的，所以要用内参去normalize目的基因，不管你怎么稀释，关键是内参和目的基因的浓度要一致，扩出来后用公式去normalize,你用的什么机器，我们用的R&D公司的IQ5可以直接在程序中分析结果。
“内参基因和目的基因的Ct值总是无法同样处在有效范围内”，楼主指的有效范围是什么？调整好程序后扩出来是什么就按什么算啊。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2015-12-1 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就是说内参基因在18个循环就起峰了，而目的基因要在34个循环后才起峰，这样怎么处理
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Darcy[使用道具]
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发表于 2015-12-1 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以考虑反转录时候加大目的基因RNA量，比如说你20ul本来用2ug，现在用4ug试试。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2015-12-1 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以更换内参基因试一下 一般内参基因有好几种 选择另外的试一下看看。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-12-1 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同意楼上。
换个内参基因试一下吧，再就是换个反转效率高的反转录酶，不过理论上这样是无法减小两个基因的Ct值差的。
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发表于 2015-12-1 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看到高手们的指点，受益匪浅。我还有个问题，我用RT-PCR扩出来的内参的Ct值要大于目的基因，反应的体系是一样的，请问可能的问题是什么？不胜感激！
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-12-1 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
鄙人也是死ct值在35 不知道该怎么办
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2015-12-1 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的实验结果目的基因CT值比内参CT值小 是正常现象吗？？？求解 谢谢
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junjie05[使用道具]
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发表于 2015-12-1 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2015-12-1 10:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的实验结果目的基因CT值比内参CT值小 是正常现象吗？？？求解 谢谢

你知道“实验结果目的基因CT值比内参CT值小 是正常现象吗？”了没有啊？
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